文章中經(jīng)?？吹?、研究中經(jīng)常用到、平時(shí)經(jīng)常聽到。。。不過很多小伙伴有時(shí)還會(huì)一臉懵，今天我們就來詳細(xì)說說雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

1雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)介紹

Dual-Luciferase^?雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)：在細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)螢火蟲螢光素酶(Firefly?Luciferase簡(jiǎn)稱F-Luc)和海腎螢光素酶(Renilla?Luciferase簡(jiǎn)稱R-Luc)，其中F-Luc作為報(bào)告基因反應(yīng)目的基因表達(dá)的改變，R-Luc作為內(nèi)參基因，為實(shí)驗(yàn)提供統(tǒng)一基準(zhǔn)線（減少內(nèi)在變化因素如培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目，細(xì)胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率對(duì)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的影響）。所構(gòu)成的報(bào)告系統(tǒng)廣泛用于基因調(diào)控、非編碼RNA靶向互作等研究領(lǐng)域。?

F-Luc表達(dá)框的上游啟動(dòng)子區(qū)域插入不同功能序列，通過轉(zhuǎn)錄起始條件改變?cè)斐善鋱?bào)告螢光的變化。F-Luc的3’UTR區(qū)域替換成靶基因的3’UTR，過表達(dá)microRNA（降解mRNA或者翻譯抑制），可以反映是否存在靶向互作。

2 應(yīng)用介紹

實(shí)驗(yàn)原理

miRNA主要通過作用于靶基因的3’UTR起作用（降解或抑制翻譯），將目的基因3’UTR（野生型和結(jié)合位點(diǎn)突變型）序列構(gòu)建至載體中報(bào)告基因F-Luc的3’端，通過比較過表達(dá)miRNA后，報(bào)告基因表達(dá)的改變（螢光素酶的活性下降還是不變），來確定miRNA與靶基因3’UTR的作用位點(diǎn)。

案列介紹

題目: Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer

期刊: Nature Communications

小結(jié)：驗(yàn)證B4GALT3（β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶III）基因具有miR-1247-3p的靶向結(jié)合位點(diǎn)。將B4GALT3預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)的序列克隆到報(bào)告基因載體，同時(shí)構(gòu)建靶位點(diǎn)突變的載體，分別共轉(zhuǎn)miR-1247-3p mimics及NC mimics，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-1247-3p 的WT組相對(duì)熒光值降低，MUT組不變，提示存在靶向結(jié)合。

  Tian Fang et al.,Nature communications，2018

相關(guān)實(shí)驗(yàn)：miRNA同lncRNA/circRNA靶向互作

實(shí)驗(yàn)原理

轉(zhuǎn)錄因子主要通過作用于靶基因的啟動(dòng)子起作用，將目的基因啟動(dòng)子區(qū)序列替換報(bào)告基因F-Luc的啟動(dòng)子，通過共表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子后，報(bào)告基因表達(dá)的改變，來確定轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)及對(duì)靶基因的作用。

案列介紹

題目：Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop

期刊：Nature Neuroscience

小結(jié)：驗(yàn)證Sox9在Sox2啟動(dòng)子區(qū)有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建不同的啟動(dòng)子片段到報(bào)告基因載體中，共表達(dá)Sox9，顯示插入片段的縮短和推測(cè)結(jié)合位點(diǎn)的減少，熒光素酶活性也隨之下調(diào)。

Jun Wang et al.,Nature neuroscience,2018

3 技術(shù)路線

根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案—預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)--構(gòu)建野生/突變報(bào)告基因載體系統(tǒng)---共轉(zhuǎn)染細(xì)胞---檢測(cè)酶活

常用靶基因結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)網(wǎng)址：

http://www./

http://genie./pubs/mir07/mir07_dyn_data.html

http://www./

常用轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)網(wǎng)址：

http://jaspardev./

http://www./

http://alggen.lsi.

4常見應(yīng)用方向總結(jié)

（1）驗(yàn)證miRNA同mRNA靶向互作。將靶mRNA的3’UTR序列插入報(bào)告基因載體，再共轉(zhuǎn)入該miRNA，如果螢光素酶活性下降，則提示為其靶序列。?

（2）?驗(yàn)證miRNA同circRNA靶向互作。將circRNA序列插入報(bào)告基因載體中F-Luc的3’UTR區(qū)域，檢測(cè)螢光素酶活性。?

（3）?驗(yàn)證miRNA同lncRNA靶向互作。將lncRNA序列插入報(bào)告基因載體中F-Luc的3’UTR區(qū)域，檢測(cè)螢光素酶活性。

（4）啟動(dòng)子活性分析。將啟動(dòng)子區(qū)域序列進(jìn)行分段截短，再分別構(gòu)建入報(bào)告基因載體，檢測(cè)其啟動(dòng)子活性。

（5）?驗(yàn)證特定轉(zhuǎn)錄因子同啟動(dòng)子的作用。將啟動(dòng)子區(qū)域插入報(bào)告基因載體，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中共轉(zhuǎn)該轉(zhuǎn)錄因子，分析轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)是否提高螢光素酶活性。?

（6）分析信號(hào)通路是否激活。將該信號(hào)通路的下游響應(yīng)原件序列構(gòu)建入報(bào)告基因載體，在不同上游信號(hào)條件下，螢光素酶活性代表了通路的下游響應(yīng)。

雙螢光素酶檢測(cè)作為機(jī)制研究的利器，在研究中應(yīng)用的越來越廣泛，現(xiàn)在和元上海隆重推出雙螢光素酶促銷活動(dòng)，并提供一站式服務(wù)，助力基礎(chǔ)科學(xué)研究！