Screening and identification of genes associated with cell proliferation in cholangiocarcinoma

膽管癌細(xì)胞增殖相關(guān)基因的篩選與鑒定

一、 研究背景

膽管癌（CCA）是一種預(yù)后較差的侵襲性腫瘤，發(fā)病率和死亡率均在增加。而CCA對常規(guī)的放療和化療都不敏感，因此探究CCA中的關(guān)鍵基因以及發(fā)現(xiàn)和設(shè)計潛在的藥物靶標(biāo)至關(guān)重要，尤其是在腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵生物學(xué)過程（如細(xì)胞增殖）中。因此，作者通過全面的泛癌分析確定了一些細(xì)胞增殖相關(guān)的基因，這些基因可能成為分子靶向治療中潛在的未來靶標(biāo)。

二、 分析流程

三、 結(jié)果解讀

1. 膽管癌的基因表達(dá)概況

作者對TCGA-CHOL的RNA測序數(shù)據(jù)，通過DeSeq2軟件包篩選表達(dá)失調(diào)的基因。在圖1A中展示了CCA的基因表達(dá)譜。接著，作者對異常表達(dá)基因和等數(shù)目的正常表達(dá)基因進(jìn)行隨機(jī)測試，發(fā)現(xiàn)只有少量的異常表達(dá)基因是功能基因（圖1B），顯示功能基因可能由于其重要的生物學(xué)作用而受到嚴(yán)格調(diào)節(jié)與穩(wěn)定表達(dá)。

在補(bǔ)充材料1E中，作者提到：在這些失調(diào)基因中可以檢測到癌癥的特征（例如生長信號的自足和抗生長信號的不敏感性），該結(jié)果提示這些異常表達(dá)的基因在腫瘤發(fā)生中有重要的生物學(xué)作用。

為了進(jìn)一步了解CCA的基因表達(dá)，作者篩選了94個顯著的表達(dá)失調(diào)基因。在16個癌癥類型中進(jìn)行測試，發(fā)現(xiàn)這些基因在至少9種癌癥中異常表達(dá)（圖1C）。這提示失調(diào)基因的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生潛在相關(guān)。

圖1C：CHOL中94個失調(diào)基因表達(dá)分布的泛癌分析

由于TCGA-CHOL的樣本量太小，因此作者結(jié)合LIHC（肝細(xì)胞肝癌）和PAAD（胰腺癌）在TCGA數(shù)據(jù)庫的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。圖1D是KM生存分析，展示這些失調(diào)基因（包括BIRC5和HRG）的表達(dá)可能與預(yù)后相關(guān)。此外，作者使用配對樣本展示BIRC5和HRG的表達(dá)模式（1E和補(bǔ)充圖1F），可見腫瘤樣本相比正常樣本，基因表達(dá)顯著差異。但在不同的癌癥樣本間表達(dá)相對穩(wěn)定。

圖1D-E：失調(diào)基因在多種癌癥樣本中的表達(dá)譜

2. 細(xì)胞增殖相關(guān)基因的篩選

由于細(xì)胞增殖過程對腫瘤的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要，因此其涉及的基因在不同的癌癥類型中應(yīng)展現(xiàn)出一致的特征。MK167是一種典型的增殖標(biāo)記，是細(xì)胞增殖的關(guān)鍵基因。同時，作者引入了10個已知的乳腺癌細(xì)胞增殖相關(guān)的基因（BIRC5，CCNB1，CDC20，CEP55，NDC80，TYMS，NUF2，UBE2C，PTGGI和RRM2）。將這11個基因用于CCA中細(xì)胞增殖相關(guān)基因的篩選。

在TCGA樣本中檢測該11基因的表達(dá)。可見在CCA中表達(dá)顯著上調(diào)，且在其他大多數(shù)癌癥中表達(dá)也上調(diào)（圖2A）。

接下來，作者對CCA數(shù)據(jù)中的94個失調(diào)基因（圖1C中展示）進(jìn)行全面的相關(guān)性分析，有15個基因與MKI67以及至少其他三個基因表達(dá)正相關(guān)（圖2B）。圖2C是相關(guān)系數(shù)r的分布圖，可見篩選出的15個基因在不同癌癥類型中顯示正的r系數(shù)，提示這些基因的過表達(dá)與癌癥形成有關(guān)。

至此，作者得到了一份26個細(xì)胞增殖相關(guān)基因的列表。這26個基因在不同癌癥類型之間展現(xiàn)動態(tài)表達(dá)，但是可一致地觀察到過表達(dá)模式（2D），這種在各種癌癥中穩(wěn)定過表達(dá)的模式意味著這些基因?qū)Π┌Y的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。

3. 功能分析展示26基因的重要生物學(xué)功能

為了進(jìn)一步了解這26個基因與癌癥的關(guān)系，作者研究了其關(guān)鍵的細(xì)胞作用及生物學(xué)功能。圖2C展示了在26個基因中，有17個被認(rèn)定為核心基因，14個是致癌基因，11個在KEGG pathway中富集，9個與癌癥的特征有關(guān)。GO分析可見有8個GO術(shù)語被富集（圖3A）。

在補(bǔ)充材料中，作者還列舉了主要富集的通路和癌癥標(biāo)志。這些結(jié)果表明篩出的26個基因具有重要的生物學(xué)作用，尤其是在細(xì)胞增殖有關(guān)的通路和生物學(xué)過程中。

圖3A：使用David平臺，基于26個候選基因顯著富集的GO術(shù)語。

作者還預(yù)測了基因表達(dá)與其他疾病的關(guān)聯(lián)。作者使用clusterProfiler繪制了這些關(guān)聯(lián)。圖3B展示了94個失調(diào)基因富集的多種疾病類型：包括口腔惡性腫瘤，浸潤性導(dǎo)管癌，慢性肝病，血栓形成和肝硬化。圖3C展示了26個與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因富集的多種疾病類型：浸潤性導(dǎo)管癌，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤和多囊卵巢疾病。以上的兩次富集分析其實都涵蓋了15個CCA中的細(xì)胞增值相關(guān)基因，但是只有浸潤性導(dǎo)管癌是共同富集的疾病類型。

圖3B-C：基因的疾病富集網(wǎng)絡(luò)

4. 26個基因的潛在合成致死遺傳相互作用

合成致死是一種遺傳相互作用，是一種前景明亮的潛在抗癌策略，可以用于鑒定治療靶標(biāo)。對于這26個細(xì)胞增殖相關(guān)基因，作者對這26個基因與其他基因之間的潛在的負(fù)面遺傳作用進(jìn)行探究。

圖4A和B中，作者分析了這些基因在33種癌癥類型中的突變譜，可見在8種癌癥類型中，可以檢查到所有的26個基因的突變；而在CCA患者中，僅有4個基因發(fā)生了突變，這可能因為其樣本量過小導(dǎo)致的。

根據(jù)已知的合成致死的基因?qū)?，作者篩查了這26個基因潛在的基因?qū)?。?3個候選基因與另外213個基因之間檢測出284個基因?qū)ΑＦ渲校?5%的基因檢測出1次相互作用，有11個基因（有10個是作者鑒別出來的候選基因）出現(xiàn)了10次以上的相互作用，尤其的，對TYMS檢測出93種相互作用（圖4C）。

此外，使用Cytoscape繪制的基因相互作用網(wǎng)絡(luò)表明，這些基因在CCA患者中展現(xiàn)出多種表達(dá)模式，其中過表達(dá)模式占主要地位（圖4D）。同時在CCA患者中，RECOL4，TOP2A，MK167和ASPM這四個突變的基因與其他基因有復(fù)雜的相互作用，與一些基因的表達(dá)還有明顯的正相關(guān)。

圖4：CCA中潛在的合成致死遺傳相互作用。

5. 26個基因在癌癥通路活性和藥物反應(yīng)中的潛在作用

為了了解這26個候選基因的潛在相關(guān)癌癥通路的作用，作者使用GSCALite進(jìn)行了相關(guān)分析。這種分析使我們能夠預(yù)測基因在癌癥相關(guān)生物通路中的激活或抑制作用。

圖5A可見大多數(shù)這些基因在相關(guān)通路中展現(xiàn)出一致的作用：包括在細(xì)胞周期和凋亡通路中的激活作用，以及在RAS / MAPK通路中的抑制作用。這些結(jié)果表明，26個候選基因總是在癌癥樣品中異常富集，過表達(dá)（圖2的結(jié)論），從而推斷出這些基因的異常表達(dá)與癌癥進(jìn)程有關(guān)系。

接下來，考慮到基因與癌癥發(fā)生之間的關(guān)聯(lián)，作者分析了他們的潛在藥物反應(yīng)，了解其作為藥物靶標(biāo)的潛在作用。對于特定的藥物，大多數(shù)基因表現(xiàn)出一致的藥物-基因關(guān)聯(lián)性。表明存在復(fù)雜的藥物-基因相互作用。在這26個基因中，只有3個基因在CCA中有明顯的藥物反應(yīng)（圖5B）。

圖5D是KM生存分析，可見候選基因TPX2與LIHC和PAAD的預(yù)后顯著相關(guān)。在補(bǔ)充材料4C和D，作者對每一個基因都進(jìn)行了KM生存分析，結(jié)果證明該26個候選基因潛在的預(yù)后價值。

圖5：藥物-基因的相互作用和某些基因的潛在生物學(xué)作用。

6. 蛋白質(zhì)表達(dá)譜和實驗驗證失調(diào)的蛋白質(zhì)

功能分析表明，某些基因可能是潛在的藥物治療靶標(biāo)。為了驗證這些基因的表達(dá)水平，作者在配對的CCA組織樣品中使用Triple TOF 5600進(jìn)行了蛋白表達(dá)譜分析。

首先作者查詢了94個失調(diào)基因的蛋白表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)其中39個基因蛋白質(zhì)高表達(dá)（圖6A）。接著對26個表達(dá)上調(diào)的基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有4個基因的蛋白質(zhì)和RNA水平為一致的高表達(dá)（圖6B和C），這證實了他們的致癌作用。

在圖6D中，對這4個一致高表達(dá)的基因，作者進(jìn)一步基于多種癌癥類型進(jìn)行藥物分析，證實CENPF可能是潛在的藥物靶標(biāo)。圖6E和補(bǔ)充圖4E展示這四個基因在生物學(xué)途徑中具有重要作用，包括在EMT途徑中的激活作用，而CENPF在凋亡，細(xì)胞周期和DNA損傷反應(yīng)中具有重要的激活作用。

最后，在圖6F-H中，進(jìn)一步的實驗驗證表明，在四種細(xì)胞系中COL10AI和CENPF均顯著上調(diào)，CTHRC1在HCCC-9810細(xì)胞系中顯著上調(diào)。COMP表達(dá)在CCT細(xì)胞系中顯著上調(diào)，但在其他細(xì)胞系中顯著下調(diào)。

圖6：通過蛋白譜分析相關(guān)蛋白的表達(dá)模式。