【原】Nature 子刊：線粒體在細胞內(nèi)的定位改變促進腫瘤轉(zhuǎn)移？阻斷線粒體運動過程抑制腫瘤遷移同時增加ROS的殺傷力

hzangs 2020-11-06

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腫瘤細胞在轉(zhuǎn)移和遷移過程中，細胞中的線粒體的亞細胞定位也會發(fā)生改變，但是具體機制并不清楚。近日，來自日本北海道大學(xué)的研究團隊在Nature Communications雜志發(fā)現(xiàn)，腫瘤侵襲相關(guān)通路Arf6-AMAP1途徑促進線粒體的運動和遷移，并抑制了ROS對腫瘤的殺傷作用。該研究結(jié)果確定了細胞運動和線粒體動力學(xué)之間的新關(guān)聯(lián)方式。

腫瘤細胞的遷移是一個復(fù)雜的過程，需要細胞內(nèi)許多生物化學(xué)和細胞生物學(xué)過程的參與。在不同類型的細胞遷移中觀察到線粒體向特定亞細胞位點的動態(tài)重新定位，而在白細胞趨化過程中線粒體在尾足上集中，在成纖維細胞和癌細胞的遷移和侵襲中觀察到線粒體向細胞邊緣的重新分布。雖然線粒體的生物能量作用已被認為在細胞運動中至關(guān)重要，但線粒體動力學(xué)如何與細胞運動協(xié)調(diào)以及這種線粒體重新定位的生物學(xué)意義的潛在機制仍有待完全闡明。

有充分證據(jù)表明，活性氧（ROS）主要通過線粒體呼吸鏈二產(chǎn)生，與癌細胞的惡性特性密切相關(guān)，包括侵襲和轉(zhuǎn)移過程。另一方面，癌細胞通常也通過上調(diào)抗氧化酶和細胞代謝的重編程顯示出強大的抗氧化能力，抵抗ROS對癌細胞的殺傷。許多抗癌治療，包括電離輻射（IR），直接或間接地增加細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，被證明有助于殺傷癌細胞。因此，癌細胞對ROS的高耐受性與癌癥治療的抗性密切相關(guān)，并且其調(diào)節(jié)被認為是癌癥治療的有希望的策略。

腫瘤細胞的治療抗性和侵襲性經(jīng)常同時被觀察到，因此被認為是相互關(guān)聯(lián)的。整合素（Integrins）在細胞運動的調(diào)節(jié)中具有主要作用，包括腫瘤侵襲，而它們還通過激活下游信號促進對包括IR在內(nèi)的治療抗性。雖然整合素介導(dǎo)的腫瘤信號已被證明可以促進其對IR治療的抵抗以及IR后其侵襲性的增強，這個過程可能通過調(diào)節(jié)線粒體參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)ROS水平的功能和線粒體定位。

研究表明，在腫瘤中經(jīng)常過表達的小GTP酶Arf6及其效應(yīng)物AMAP1通過影響整合素的定位在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥性方面具有至關(guān)重要的作用。 Arf6和AMAP1的表達水平與腫瘤細胞的侵襲活性高度相關(guān)，并且這兩個蛋白促進癌癥侵襲期間內(nèi)化的β1-整合素再循環(huán)回質(zhì)膜。在這個過程中，Arf6-AMAP1途徑通過蛋白激酶D2（PRKD2）直接結(jié)合β1整合素的細胞內(nèi)部分。PRKD2的表達水平在腫瘤細胞中沒有明顯變化，因此不是Arf6-AMAP1-PRKD2通路的決定因素，但表皮生長因子受體（EGFR）信號傳導(dǎo)可激活另一種小GTP酶Rab5c作為AMAP1-PRKD2相互作用的正調(diào)節(jié)因子。同時，EGFR還通過GTP交換因子GEP100 / BRAG223激活A(yù)rf6，這對于通過其Arf GAP結(jié)構(gòu)域?qū)MAP1與Arf6結(jié)合起來至關(guān)重要。另一方面，Arf6-AMAP1途徑也可能通過某些未知機制促進腎癌和乳腺癌細胞的耐藥性。盡管Arf6-AMAP1-PRKD2途徑在腫瘤侵襲中的重要作用已經(jīng)如上所述，但該途徑如何影響細胞應(yīng)激，如何通過調(diào)節(jié)整合素功能和ROS調(diào)節(jié)來影響耐藥性，仍然很大程度上未知。

在這項研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)Arf6-AMAP1途徑在控制線粒體定位中起關(guān)鍵作用，這對于阻止高侵襲性乳腺癌細胞中的ROS失活和細胞侵襲至關(guān)重要。阻斷該途徑增加細胞內(nèi)ROS水平并誘導(dǎo)微管組織中心附近的線粒體聚集。由線粒體聚集引起的線粒體密集網(wǎng)絡(luò)中觀察到ROS增加，其類似于ROS誘導(dǎo)的心肌細胞的ROS釋放（RIRR）。 Arf6-AMAP1途徑是整合素連接激酶（ILK）有效定位于粘著斑（FAs）所必需的，調(diào)節(jié)由運動銜接因子RhoT和TRAK介導(dǎo)的線粒體運輸。 RhoT-TRAK介導(dǎo)的線粒體動力學(xué)調(diào)控在高侵襲性乳腺癌細胞中非常普遍，并且抑制線粒體遷移、降低腫瘤細胞侵襲性并增加細胞內(nèi)ROS水平。類似RIRR的ROS增加顯著增強了穩(wěn)定狀態(tài)和ROS通過激活caspase-3誘導(dǎo)ROS后細胞死亡，而DNA損傷和修復(fù)基本上沒有受到影響。這些發(fā)現(xiàn)表明細胞遷移和線粒體動力學(xué)之間存在新的分子聯(lián)系，這對于高侵襲性腫瘤的侵襲活性和對ROS的耐受性都是至關(guān)重要的。研究結(jié)果也提出了新的策略，以提高類似IR等ROS介導(dǎo)的癌癥治療的功效。

結(jié)果：

1. Arf6-AMAP1細胞侵襲信號通過能夠重編程線粒體分布和ROS水平。

A.B 用siRNA敲低Arf6-AMAP1信號通路增加了ROS（紅色信號）的產(chǎn)生。

C.D 用siRNA敲低Arf6-AMAP1信號通路增加ROS水平并促進細胞死亡，使用EUK134（過氧化氫酶類似物）后抑制ROS水平。

E.F. 用siRNA阻斷Arf6-AMAP1通路明顯增加了位于細胞質(zhì)（e）和線粒體（f）中的roGFP2的氧化反應(yīng)。

G. H.I. 用siRNA阻斷Arf6-AMAP1通路抑制了線粒體（綠色）向細胞周圍的分布，促進聚集，并通過數(shù)學(xué)模型進行了量化。

J.K. 但是，用siRNA阻斷Arf6-AMAP1通路后，線粒體內(nèi)的DNA量以及線粒體的呼吸量OCR值均未受到影響，表明Arf6-AMAP1信號對ROS的調(diào)節(jié)不是通過影響線粒體本身實現(xiàn)，而是影響的線粒體的遷移。

2. 線粒體在乳腺癌細胞內(nèi)的聚集，增加了ROS的產(chǎn)生。

A. 線粒體（紅色信號）稀疏（Sparse）和密集（Dense）狀態(tài)下，ROS（H2O2，綠色信號）的量分別顯示較少和較多。

B. 線粒體稀疏（Sparse）和密集（Dense）狀態(tài)下，ROS的產(chǎn)生量隨時間的增加情況（線粒體密集時ROS增加多）。

C. D. 研究人員開發(fā)了一個系統(tǒng)，將MTS-FKBP和BICD2N-FRB*分別錨定在線粒體膜上，用雷帕霉素類似物（Rapalog）可以誘導(dǎo)這二者的結(jié)合，使線粒體（綠色）聚集。

E.F.Rapalog誘導(dǎo)線粒體聚集后，ROS信號（紅色）增強。

3. 線粒體聚集通過ROS增加，增強電離輻射誘導(dǎo)的細胞死亡。

A. 用siRNA抑制Arf6-AMAP1通路，增加了電離輻射對乳腺癌細胞的敏感性。

B. 而消除細胞內(nèi)ROS后，細胞對電離輻射敏感性降低。

C. 雷帕霉素類似物（Rapalog）誘導(dǎo)線粒體聚集后，細胞對電離輻射敏感性增加。

D.E. 但是用H2O2處理細胞使細胞ROS增加，但是H2O2處理并不增加細胞對電離輻射的敏感性，表明電離輻射本身帶來的ROS增加不會影響細胞的放療敏感性。

F. siRNA抑制Arf6和AMAP1，增加了Caspase3的活化，電離輻射后，Caspase3的活化程度增加。

G. 泛Caspase抑制劑Z-VAD-FMK處理后，Arf6-AMAP1通路對電離輻射敏感性的影響降低。這些結(jié)果表明線粒體聚集引起ROS增加，是通過活化Caspase3凋亡途徑實現(xiàn)細胞死亡。

4. 整合素連接激酶（ILK）在粘著斑（FAs）上的定位調(diào)節(jié)線粒體在細胞內(nèi)的分布。

A. RhoT1和RhoT2與ILK47結(jié)合介導(dǎo)整合素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。蛋白質(zhì)相互作用實驗證實ILK通過其含有激酶結(jié)構(gòu)域的C末端部分與RhoT1結(jié)合。

B. 內(nèi)源co-IP證明ILK與RhoT1相互作用。

C. D. 抑制Arf6-AMAP1通路并不改變ILK蛋白表達，改變的是ILK在粘著斑（FAs）上的分布。

E-K 用siRNA抑制ILK后（E-F），誘導(dǎo)線粒體的聚集（G I）以及ROS的產(chǎn)生（H J K）。

5. Arf6-AMAP1途徑通過ILK抑制RhoT1-TRAK2相互作用從而重新分布線粒體。

A-C.RhoT通過銜接蛋白家族TRAK/Milton實現(xiàn)與微管的連接。敲低TRAK1后線粒體聚集，而敲低TRAK2后線粒體則向細胞周圍分布。表明TRAK1和TRAK2在乳腺癌細胞中的作用是線粒體的順向和逆向運送線粒體。

D-F. AMAP1、Arf6或ILK的敲低誘導(dǎo)線粒體的聚集以及ROS的增加，但是敲除TRAK2后這些現(xiàn)象會消失。

G. H. 敲除AMAP1、Arf6或ILK后，RhoT1與TRAK2的結(jié)合能力明顯增加，但是不影響RhoT1與TRAK1的結(jié)合。

I. 敲除AMAP1、Arf6后，不影響ILK和RhoT1的結(jié)合。

J. K. 敲除TRAK1后，ROS明顯增加；而TRAK2的敲除不影響ROS。

I. TRAK2敲低后細胞死亡增加，但在接受電離輻射后之后并沒有增加敏感性，也就是說TRAK2對線粒體以及細胞死亡的調(diào)節(jié)與ROS直接影響無關(guān)。

6. TRAK1通過控制線粒體運輸促進腫瘤細胞侵襲。

A. 高侵襲性的乳腺癌細胞（標(biāo)注H）中的TRAK1和TRAK2的蛋白質(zhì)表達水平更高。

B. C. 但是TRAK1和TRAK2的mRNA水平在高低侵襲性乳腺癌細胞中水平差距不大。

D. 敲低TRAK1明顯降低了MD-MB-231細胞的侵襲性，但是TRAK2不會。

E. Rapalog誘導(dǎo)的線粒體向中央聚集，也降低了細胞的侵襲性。

F. 但是TRAK1和TRAK2均不會影響細胞在膠原蛋白表面的隨機遷移速度。這些結(jié)果表明，TRAK1介導(dǎo)的線粒體順向運輸有助于腫瘤細胞侵襲。

7. ILK-RhoT-TRAK途徑調(diào)節(jié)高侵襲性乳腺癌細胞中的線粒體重新分布。

A. 抑制Arf6-AMAP1通路，ILK蛋白趨向MDA-MB-231細胞質(zhì)的外圍分布。

B. C. 在侵襲性較弱的MCF7細胞中，抑制TRAK1不影響MCF7的線粒體分布。

D-F 浸潤性、侵襲性強的乳腺癌細胞系MDA-MB-435中，AMAP1、Arf6、ILK或TRAK1的敲低顯著抑制線粒體的細胞質(zhì)外圍分布，趨向于中心聚集。

8. 由Arf6-AMAP1-ILK途徑調(diào)節(jié)的線粒體分布的示意圖。

侵襲性腫瘤細胞中Arf6-AMAP1途徑介導(dǎo)的整合素循環(huán)對于成熟粘合斑FA的形成是必需的（1）。在FAs（2）處形成或募集的ILK-RhoT1復(fù)合物可能與粘附復(fù)合物的一些其他組分相互作用，這導(dǎo)致RhoT1的分子特性的改變。修飾的RhoT1被釋放出來并嵌入線粒體外膜（3），并負向調(diào)節(jié)RhoT1和TRAK2之間的相互作用，導(dǎo)致線粒體的順向運輸相對增加（4）。另一種可能性是錨定在線粒體外膜上的RhoT1可能與ILK相互作用，ILK彌散于細胞質(zhì)中，當(dāng)線粒體之間相互靠近聚集時，可能發(fā)生上述修飾（2'）。這些機制的破壞降低了侵襲性并增強了RhoT1和TRAK2之間的分子相互作用，RhoT1和TRAK2優(yōu)先介導(dǎo)線粒體逆行運輸（i）。由此引起的線粒體聚集導(dǎo)致ROS擴增（ii）。