胞嘧啶甲基化是DNA中廣泛存在的一種修飾，發(fā)揮重要的作用。在酵母新型隱球菌(Cryptococcus neoformans),CG甲基化發(fā)生在富含轉(zhuǎn)座子的重復(fù)序列中，而且需要DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt5?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)Dnmt5在體內(nèi)和體外都表現(xiàn)出精確的甲基化維持特異性，并且在體內(nèi)顯示出與后生動(dòng)物維持甲基化的Dnmt1酶利用相似的輔酶因子。值得注意的是，系統(tǒng)發(fā)育和功能研究顯示，祖先物種在50 到150 百萬(wàn)年前丟失了重頭甲基化酶DnmtX基因。文中作者分析了自遠(yuǎn)古DnmtX丟失以來(lái)甲基化是如何維持的。實(shí)驗(yàn)和比較研究揭示了在酵母新型隱球菌甲基化模式如何得以有效復(fù)制，復(fù)制過(guò)程中極少出現(xiàn)甲基化的隨機(jī)缺失和獲得，以及自然選擇的作用。作者認(rèn)為表觀遺傳通過(guò)一種類似于達(dá)爾文基因組進(jìn)化的方式，已經(jīng)被繁殖了不少于5000萬(wàn)年。

DNA胞嘧啶五碳甲基化(5mC)存在于各種生命體?？赡芤?yàn)樗幕蚪M防御重要功能，所有已知的脊椎動(dòng)物和陸生植物DNA都有這種修飾。5mC初始因各種重頭甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)作用于非甲基化胞嘧啶而產(chǎn)生。在回文序列，如CG和CHG中，兩條鏈的胞嘧啶都被甲基化。這種初始修飾形態(tài)在DNA復(fù)制過(guò)程中被維持甲基化酶“記住”，并對(duì)復(fù)制產(chǎn)生的半甲基化鏈發(fā)揮功能。哺乳動(dòng)物DNA甲基化系統(tǒng)就是一個(gè)類似分工的例子。Dnmt 3a/b和Dnmt3L復(fù)合物行使重頭甲基化功能，一但DNA甲基化在生殖細(xì)胞和胚胎發(fā)育過(guò)程中建立，Dnmt1酶將聯(lián)合UHRF1進(jìn)行維持。UHRF1可以識(shí)別H3K9me和半甲基化5mC的蛋白質(zhì)。這種重頭甲基化和維持甲基化的分工模式同樣存在于陸生植物，盡管Dnmt3在被子植物中丟失且被其它酶替代。DNA甲基化對(duì)發(fā)育至關(guān)重要，在轉(zhuǎn)座因子沉默、染色體穩(wěn)定性、單等位基因表達(dá)和基因沉默等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外，Dnmt3a是急性髓性白血病常見(jiàn)的突變驅(qū)動(dòng)基因，Dnmt3b突變導(dǎo)致常染色體隱性遺傳病免疫缺陷、著絲粒區(qū)不穩(wěn)定、面部異常等。

雖然后鞭毛生物基因組幾乎都至少編碼兩種甲基化轉(zhuǎn)移酶同系物，但個(gè)別物種只編碼一個(gè)，人類病原真菌新型隱球菌就是其一，它是一種擔(dān)子酵母菌類，在轉(zhuǎn)座子富集的著絲粒和亞著絲粒區(qū)域具有對(duì)稱的CG甲基化。該甲基化修飾依賴于DMT5基因編碼的胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt5，該基因?yàn)樾滦碗[球菌感染適應(yīng)性所必須。Dnmt5蛋白家族的特征是具有一個(gè)N-末端染色質(zhì)域（CD），其后依次為胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶催化域、環(huán)指結(jié)構(gòu)和SNF2型腺苷三磷酸酶（ATPase）相關(guān)的域組成（圖1A）。這種推測(cè)甲基化轉(zhuǎn)移酶在真菌和綠藻中廣泛存在，其中一些物種CG甲基化已被證實(shí)可影響核小體定位。5mC在新型隱球菌中聚集在富含轉(zhuǎn)座元件的重復(fù)序列上，這可能與真菌類隱球菌Cryptococcus deuterogattii發(fā)揮類似的轉(zhuǎn)座子沉默功能。DMT5基因失活突變伴隨Cryptococcus deuterogattii的5mC丟失。以下為作者探索Cryptococcus neoformans菌Dnmt5描述。

1.新型隱球菌5mC促進(jìn)因子

已報(bào)到在新型隱球菌中，5mC修飾區(qū)域同時(shí)伴隨H3K9me修飾。由此，作者通過(guò)將已純化的含有CD結(jié)構(gòu)域的片段與商業(yè)化集成人不同組蛋白修飾芯片結(jié)合，測(cè)試Dnmt5的CD結(jié)構(gòu)域能否識(shí)別這一組蛋白修飾標(biāo)記。結(jié)果H3K9me和H3K27me修飾肽均產(chǎn)生信號(hào)。然而，由于C. neoformans與人組蛋白H3的27位賴氨酸周圍序列差異，作者進(jìn)一步通過(guò)熒光偏振評(píng)估了染色質(zhì)域與C. neoformans組蛋白H3序列的結(jié)合能力（圖1B）。H3K9me的結(jié)合強(qiáng)度比H3K27me結(jié)合強(qiáng)度大幅增強(qiáng)顯示H3K9me為CD的主要結(jié)合配體。

為進(jìn)一步評(píng)估H3K9me是否影響5mC，作者敲除C. neoformans中H3K9僅有的甲基轉(zhuǎn)移酶基因Clr4，用甲基化敏感酶（HpyCH4IV；A?CGT）消化基因組DNA，然后Southern雜交測(cè)定5mC?；谝寻l(fā)表的野生型新型隱球菌5mC圖譜，作者設(shè)計(jì)了一個(gè)唯一識(shí)別著絲粒13的特異性探針（probe U）（圖1C）。此外，還設(shè)計(jì)了另一個(gè)識(shí)別重復(fù)著絲粒序列的探針（probe R），實(shí)現(xiàn)一次性分析多個(gè)著絲粒5mC位點(diǎn)的分布。在探針檢測(cè)區(qū)域，clr4敲除（clr4Δ）菌株的5mC水平顯著降低，而dmt5敲除（dmt5Δ）菌株或DNMT催化結(jié)構(gòu)域或ATPase結(jié)構(gòu)域催化殘基突變的菌株沒(méi)有產(chǎn)生5mC修飾（圖1D）。染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（ChIP-seq）分析FLAG-Dnmt5發(fā)現(xiàn)其募集到H3K9me結(jié)構(gòu)域顯著減少。相反，Dnmt5染色質(zhì)域的一個(gè)廢除其結(jié)合H3K9me（W87A，Y90A）的突變對(duì)5mC的影響很小，這表明存在其它H3K9me依賴性因子影響5mC水平（圖1E）。異染色質(zhì)蛋白1（HP1）家族包括多種保守蛋白，可通過(guò)與H3K9me結(jié)合，參與異染色質(zhì)形成，并促使5mC甲基化。在C. neoformans中，作者根據(jù)裂殖酵母同源基因特征，鑒定了一個(gè)HP1種間同源基因，命名為Swi6。雖然swi6敲除對(duì)5mC影響較輕，但swi6 敲除和dmt5-W87A，Y90A共突變比clr4敲除降低了5mC的水平（圖1E）。免疫沉淀結(jié)合質(zhì)譜和免疫共沉淀檢測(cè)顯示Swi6和Dnmt5物理結(jié)合，表明H3K9me通過(guò)Dnmt5的CD結(jié)構(gòu)域和HP1蛋白兩種方式招募Dnmt5促使5mC形成。

圖1 A-F

缺失H3K9me的細(xì)胞仍殘留5mC讓作者進(jìn)一步探索DNA甲基化的其它相關(guān)因子。C. neoformans具有一種類似于Uhrf1的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)包含SRA結(jié)構(gòu)域（圖1F），但缺失人種間同源基因的H3K9me讀取Tudor結(jié)構(gòu)域和RING E3連接酶結(jié)構(gòu)域。運(yùn)用非變性凝膠電泳，作者檢測(cè)了C. neoformans重組Uhrf1與6個(gè)CG位點(diǎn)分別進(jìn)行無(wú)甲基化、半甲基化和對(duì)稱甲基化標(biāo)記的DNA結(jié)合的能力。結(jié)果顯示Uhrf1選擇性地結(jié)合半甲基化DNA（圖1F）。Uhrf1（uhf1敲除）缺失對(duì)體內(nèi)5mC的影響幾乎檢測(cè)不到，但當(dāng)與Clr4共缺失（clr4敲除加uhf1敲除）時(shí)，捕獲的5mC分布略有改變（圖1G）。

為了在全基因組范圍內(nèi)分析這些基因型，作者通過(guò)全基因組甲基化測(cè)序檢測(cè)了野生型、dmt5敲除、clr4敲除、uhf1敲除和clr4及uhf1共敲除菌株DNA甲基化分布（圖1H）。對(duì)比clr4缺失，clr4和uhf1雙缺失菌株DNA的CG二核苷酸對(duì)稱甲基化從31%減少到11%（圖1I和1J）。分析表明，Uhrf1和Clr4通過(guò)兩條平行的途徑促使了5mC的形成（圖1J）。

圖1 G-J

2. 純化的Dnmt5顯示出精確的維持甲基化的特異性

在C. neoformans中，Dnmt5與Uhrf1同系物行使功能，并可以獨(dú)自識(shí)別H3K9me，這種特征讓作者聯(lián)想到哺乳動(dòng)物甲基化系統(tǒng)的維持。作者因此檢測(cè)Dnmt5是否具有維持酶期望的底物特異性。通過(guò)釀酒酵母表達(dá)并純化全長(zhǎng)Dnmt5。通過(guò)S-[³H-甲基]-腺苷甲硫氨酸供體和合成的20bp雙鏈DNA寡核苷酸底物進(jìn)行甲基轉(zhuǎn)移酶分析，這些底物含有6個(gè)CG位點(diǎn)，進(jìn)行未甲基化，半甲基化，或者所有CG位點(diǎn)對(duì)稱甲基化修飾。與缺乏Dnmt5的對(duì)照相比，在ATP缺失情況下，Dnmt5對(duì)任何底物未顯示活性（圖2A）。然而，在ATP存在條件下，與人Dnmt1催化速率相當(dāng)，Dnmt5僅對(duì)半甲基化底物表現(xiàn)活性（圖2A和2B）。此外，不管胞嘧啶甲基化狀態(tài)如何，Dnmt5對(duì)CHG序列未表現(xiàn)出像對(duì)CG序列的活性，表明Dnmt5酶的CG二核苷酸特異性。

由于Dnmt5染色質(zhì)域識(shí)別H3K9me，作者通過(guò)體外引入H3K9Me3肽分析是否存在重頭甲基化活性。在甲基化或無(wú)甲基化修飾H3K9肽的形況下，半甲基化底物的比率相當(dāng)，且對(duì)非甲基化DNA底物沒(méi)有影響（圖2C和2D）。作者進(jìn)一步測(cè)試是否重組Uhrf1和Swi6可以觸發(fā)重頭甲基化活性，但并未發(fā)現(xiàn)。作者因此得出結(jié)論，Dnmt5是一種在體外作用于半甲基化底物的維持酶，對(duì)非甲基化底物沒(méi)有活性。

3. 5mC在機(jī)體內(nèi)通過(guò)維持機(jī)制而繁殖

盡管Dnmt5在體外顯示了維持酶的底物專一性，但在體內(nèi)它與其它因子共同作用可能改變其性質(zhì)。分析這個(gè)問(wèn)題的一個(gè)方法是從細(xì)胞中去除Dnmt5，讓甲基化丟失，然后重新引入這個(gè)酶。如果Dnmt5在細(xì)胞中起維持酶的作用，那么DNA甲基化將不能在基因組范圍內(nèi)被重新恢復(fù)，因?yàn)樗陌爰谆孜镆呀?jīng)丟失。

作者首先構(gòu)建了半乳糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制Dnmt5基因表達(dá)，pGAL-DMT5（圖3A），該等位基因N末端進(jìn)行2XFLAG標(biāo)簽表位標(biāo)記。通過(guò)對(duì)葡萄糖抑制的20（I₂₀）或45（I₄₅）代篩選菌株誘導(dǎo)表達(dá)Dnmt5蛋白，作者通過(guò)Southern雜交未檢測(cè)到5mC，而構(gòu)建的Dnmt5表達(dá)顯著（圖3A）。為了評(píng)估pGAL-DMT5等位基因是否起作用，靶向構(gòu)建物進(jìn)而轉(zhuǎn)化野生細(xì)胞，并運(yùn)用誘導(dǎo)pGAL7進(jìn)行篩選（圖3B）。誘導(dǎo)條件下I₀代菌株與野生型菌株的5mC無(wú)可辨差異，表明可誘導(dǎo)的標(biāo)記的等位基因是發(fā)揮功能的。隨后，抑制pGAL-DMT5，5mC丟失。進(jìn)一步再次誘導(dǎo)40（I₄₀）或90（I₉₀）代菌株的Dnmt5，未能檢測(cè)到5mC。為確認(rèn)細(xì)胞僅部分去除5mC后，如通過(guò)核形成傳播機(jī)制（nucleation-spread），甲基化修飾能否被恢復(fù)，作者建立了抑制pGAL-DMT5有限代數(shù)后（R）再誘導(dǎo)（I）的時(shí)序?qū)嶒?yàn)。在抑制條件下，25代后5mC大幅降低。然而，當(dāng)轉(zhuǎn)移到含半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，作者未觀察到5mC的恢復(fù)（圖3C和3D）。

圖3

作者進(jìn)一步運(yùn)用不同方法進(jìn)行了類似的分析。首先敲除部分DMT5基因，再重新引入缺失DNA序列（圖4），重新引入的等位基因稱為RI-DMT5。盡管RI-DMT5的表達(dá)與野生型相當(dāng)，但Southern雜交檢測(cè)不到5mC（圖4A）。Dmt5敲除菌株全基因組甲基化測(cè)序顯示所有CG位點(diǎn)無(wú)甲基化修飾（圖4B）。對(duì)兩株RI-dmt5菌株測(cè)序發(fā)現(xiàn)，除了兩個(gè)位點(diǎn)外，5mC在全基因組范圍缺失（圖4B）。進(jìn)一步通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜對(duì)從野生型、dmt5Δ和RI-DMT5基因組DNA分析，結(jié)果顯示野生型gDNA中5mC（5mC/dG）為0.33%，dmt5Δ未檢測(cè)到， RI-DMT5菌株為痕量（可檢測(cè)但低于量化限值）（圖4C）。這種痕量活性表明，Dnmt5對(duì)未修飾DNA的活性可能非常低，并來(lái)源于維持酶活性的記憶。

H3K9me組蛋白修飾在dmt5Δ和RI-DMT5菌株仍然全基因組分布，盡管與野生型相比分布有所改變，且在子端粒區(qū)域信號(hào)變強(qiáng)（圖4D）。此外，ChIP-seq測(cè)序證明RI-Dnmt5蛋白仍舊定位在異染色質(zhì)區(qū)域（圖4E）。

為了明確RI-DMT5是否能夠有效地維持DNA甲基化，一種著絲粒13被耐藥標(biāo)記（CEN13：：natR）的野生型菌株，其與RI-DMT5菌株雜交（圖4F）。從雜交后代篩選出具有RI-DMT5等位基因和著絲粒標(biāo)記的減數(shù)分裂后代。CEN13特異性探針進(jìn)行Southern雜交檢測(cè)其5mC。所有子代都呈現(xiàn)野生型5mC模式（圖4F）表明RI-DMT5等位基因可在存在甲基化底物條件下發(fā)揮功能。

許多物種需要一種或多種重頭甲基化酶通過(guò)有性生殖建立5mC。有研究稱，串聯(lián)重復(fù)URA5標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因在C. neoformans交配和減數(shù)分裂/產(chǎn)孢后，因RNA干擾而非DNA甲基化形成可遺傳性沉默。盡管如此，為了確定非甲基化著絲粒經(jīng)有性生殖能否發(fā)生甲基化修飾，作者通過(guò)兩種遺傳雜交分析減數(shù)分裂后代。在對(duì)照組，將CEN13::natR菌株與dmt5D菌株雜交，運(yùn)用CEN13特異探針和Southern雜交分析同時(shí)包含CEN13標(biāo)記和野生型DMT5等位基因的三個(gè)子代。如預(yù)期的那樣，子代甲基化在5mC修飾的著絲粒上得以維持（圖4G）。在實(shí)驗(yàn)組，將野生型菌株與含有dmt5Δ等位基因缺失且同時(shí)攜帶CEN13::natR的菌株雜交，同樣分析了表達(dá)野生型DMT5等位基因和標(biāo)記著絲粒的三個(gè)子代，它們是以非甲基化狀態(tài)進(jìn)入雜交的。結(jié)果顯示子代仍然沒(méi)有發(fā)生甲基化修飾，這表明Dnmt5能夠維持甲基化，但是不能在完全失去甲基化的著絲粒上重新建立（圖4H）。因此，有性生殖并不能有效恢復(fù)5mC。最后，作者將細(xì)胞置于多種應(yīng)激條件下，確定RI-DMT5菌株能否重建甲基化，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)。

為評(píng)估Dnmt5甲基化維持特異性是否依賴于內(nèi)源序列特性，作者通過(guò)HpaII甲基轉(zhuǎn)移酶（產(chǎn)生對(duì)稱的CmCGG）體外構(gòu)建了一個(gè)富含HpaII位點(diǎn)的DNA甲基化片段，并將其整合到C. neoformans著絲粒4右側(cè)邊界的基因組中，以使其接近H3K9me修飾的染色質(zhì)（圖5A-5C）。轉(zhuǎn)化株DNA經(jīng)5mC敏感性HpaII限制性內(nèi)切酶消化，通過(guò)酶切位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)引物，qPCR分析甲基化相對(duì)水平（圖5D）。結(jié)果顯示除了CG二核苷酸特異性外，體內(nèi)似乎沒(méi)有維持甲基化的序列特異性要求，這與生化結(jié)果一致。

接下來(lái)作者通過(guò)體外甲基化位點(diǎn)作為成核位點(diǎn)（nucleation sites）來(lái)檢測(cè)5mC是否能在體內(nèi)擴(kuò)展。運(yùn)用5mC敏感酶BstUI（CGCG）和Hpy99I（CGWCG）切割基因組DNA，并對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行qPCR分析。結(jié)果未觀察到高于背景以上的任何信號(hào)，這表明5mC修飾未擴(kuò)散到臨近的CG二核苷酸上（圖5E）。體外觀察到類似的結(jié)果：作者將純化的Dnmt5與不含CG位點(diǎn)、兩個(gè)未甲基化CG位點(diǎn)或兩個(gè)未甲基化CG位點(diǎn)且伴有一個(gè)對(duì)稱甲基化CG位點(diǎn)的雙鏈DNA底物孵育（圖5F）。雖然在與細(xì)菌DMT M.SssI孵育的對(duì)照產(chǎn)物檢測(cè)到甲基化產(chǎn)物，但與Dnmt5孵育的產(chǎn)物沒(méi)有檢測(cè)到甲基化信號(hào)，這表明即使存在臨近甲基化位點(diǎn)，該酶也無(wú)重頭甲基化活性（圖5F）。

圖5 E-F

3. 祖先物種重頭甲基化酶基因丟失

鑒于Dnmt5是C. neoformans基因組預(yù)測(cè)的唯一的甲基轉(zhuǎn)移酶，并且似乎起甲基化維持作用，那5mC是如何建立的？為了探索這一問(wèn)題，作者研究C. neoformans屬生物家族——銀耳科(Tremellaceae)基因組。與C. neoformans基因組密切相關(guān)的物種包括人類致病菌Cryptococcus gattii和非致病菌Cryptococcus amylolentus和Cryptococcus wingfieldii，僅含一個(gè)預(yù)測(cè)的與Dnmt5是同源的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（圖6A）。C. deuterogattii所有轉(zhuǎn)座子失活并失去RNAi和5mC。另一個(gè)最接近的物種，Cryptococcus depauperatus，缺乏預(yù)測(cè)的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，同樣暗含DMT5在其進(jìn)化過(guò)程中丟失（圖6A）。值得注意的是，較遠(yuǎn)物種同時(shí)編碼Dnmt5和一種未知的預(yù)測(cè)性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，稱為DnmtX（基因座位：DMX1）（圖6A）。該預(yù)測(cè)蛋白包含一個(gè)溴相關(guān)同源（BAH）域和一個(gè)Dnmt催化結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)發(fā)育模式顯示DMX1基因在C. neoformans和C. depauperatus的共同祖先中丟失，并且C. depauperatus后續(xù)同時(shí)丟失了DMT5基因。由于Dnmt5是一種維持性甲基化酶，作者提出DnmtX是一種重頭甲基轉(zhuǎn)移酶的設(shè)想。

作者分別從Kwoniella mangroviensis, Kwoniella bestiolae和Kwoniella pini中克隆DnmtX基因進(jìn)行假設(shè)驗(yàn)證?？寺』蚍謩e插入pGAL7半乳糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子且N末端進(jìn)行血球凝集素表位標(biāo)簽標(biāo)記。隨后將其轉(zhuǎn)基因到C. neoformans菌株，且C. neoformans菌株先前通過(guò)基因改造，包括破壞Dnmt5基因，然后通過(guò)FLAG標(biāo)記的等位基因（RI-DMT5）修復(fù)。之所以選用該技術(shù)是基于作者認(rèn)為DnmtX酶可能難以有效生成5mC，特別是重頭甲基化相關(guān)的重要輔酶因子沒(méi)有被引入。

因?yàn)樗A(yù)測(cè)用DnmtX酶建立5mC可能是低效的，特別是在沒(méi)有引入對(duì)新甲基化重要的輔助因子的情況下。

含有半乳糖的培養(yǎng)基誘導(dǎo)每個(gè)菌株表達(dá)DnmtX，然后提取DNA。采用甲基化DNA免疫沉淀測(cè)序（MeDIP-seq）和全基因組亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）兩種技術(shù)進(jìn)行全基因組5mC水平檢測(cè)。兩種檢測(cè)技術(shù)在三種菌株中都觀察到廣泛的積累了5mC，主要集中在著絲粒區(qū)域（圖6B）。這些數(shù)據(jù)表明，三種DnmtXs在體內(nèi)都為重頭甲基化轉(zhuǎn)移酶，證明了祖先DnmtX也具有這種功能。

圖6 A-B

3. 實(shí)驗(yàn)演化揭示維持5mC的保守性

祖先DnmtX基因丟失發(fā)生在C. neoformans和C. depauperatus分化之前，Tremella mesenterica和 Kwoniella heveanensis分化之后（圖6A）。C. neoformans和C. gattii分化時(shí)間預(yù)計(jì)在34至49 百萬(wàn)年前。鑒于系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，C. neoformans和C. depauperatus的分化時(shí)間要更為遠(yuǎn)古。C. neoformans和T. mesenterica的共同祖先預(yù)計(jì)生活在153百萬(wàn)年前。因此，DMX1基因可能在150到50百萬(wàn)年前期間丟失。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，Dnmt5在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)維持了5mC，致使致病性Cryptococcus種群的形成。

為了解5mC是如何自DnmtX遠(yuǎn)古消失以來(lái)進(jìn)行持續(xù)的，作者對(duì)C. neoformans進(jìn)行演化實(shí)驗(yàn)。野生型（第0代或g0代）單菌落在充足的液體培養(yǎng)基中繁殖120代，無(wú)菌落瓶頸。培養(yǎng)液稀釋后涂布瓊脂糖平板，形成單菌落。挑取兩個(gè)獨(dú)立克隆，同時(shí)對(duì)其親代分別進(jìn)行全基因組亞硫酸鹽測(cè)序，進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)（圖6C）。對(duì)比親代分別檢測(cè)到50個(gè)和38個(gè)甲基化位點(diǎn)丟失（圖6D和圖6E），表明99.0%和99.2%的5mC位點(diǎn)在120代得以維持。兩個(gè)克隆共同丟失的甲基化位點(diǎn)只有兩個(gè)，應(yīng)該為偶然發(fā)生的重疊（圖6E）。假設(shè)所有位點(diǎn)同等維持甲基化信息，并為一階動(dòng)力學(xué)，那么單個(gè)5mC位點(diǎn)每一代的丟失率為 9.3 X 10^-5。與重復(fù)性實(shí)驗(yàn)一致，作者在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中觀察到新增5個(gè)甲基化位點(diǎn)（圖6E）。通過(guò)未甲基化位點(diǎn)評(píng)估，每一代甲基化位點(diǎn)實(shí)際獲得的概率為4.5*10^-6。

圖6 C-E

3. 進(jìn)化分析揭示5mC甲基化圖譜的保守型

 作者首先試圖比對(duì)具有四個(gè)明顯分化枝，VNI、VNII、VNBI和VNBII，共同享有約4.7百萬(wàn)年前祖先的分化菌的著絲粒區(qū)域（圖7A）。由于甲基化富集區(qū)著絲粒含有包括gypsy 和 copia 的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Tcn1-Tcn6 六個(gè)家族，數(shù)百個(gè)菌株的短讀長(zhǎng)測(cè)序數(shù)據(jù)仍無(wú)法組裝。進(jìn)一步作者通過(guò)牛津Nanopore（ONT）對(duì)四個(gè)分化枝的各兩個(gè)分離株進(jìn)行幾乎全長(zhǎng)測(cè)序（圖7B）。著絲粒點(diǎn)陣圖分析顯示序列存在廣泛的重排（插入、缺失、倒置），排除了端到端多序列比對(duì)。作者通過(guò)對(duì)八個(gè)組裝基因組著絲粒片段間的局部比對(duì)實(shí)現(xiàn)一系列雙端比對(duì)序列。這些菌株平均88.5%的著絲粒區(qū)域至少比對(duì)到另外一種菌株的同源著絲粒，序列中位數(shù)比對(duì)長(zhǎng)度在607bp。對(duì)每一菌株重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的全基因組甲基化數(shù)據(jù)分析，并將數(shù)據(jù)與組裝序列進(jìn)行關(guān)聯(lián)。圖7C展示了其中A1-35-8(紅色片段)的CEN4與其它七個(gè)分離株(藍(lán)色片段)著絲粒雙比對(duì)序列關(guān)系，結(jié)果顯示CG位點(diǎn)的5mC狀態(tài)可以在任意選取菌株（A1-35-8）的著絲粒和其它七個(gè)菌株同源著絲粒的甲基化狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。接下來(lái)，對(duì)于每一個(gè)菌株中的每一個(gè)著絲粒CG位點(diǎn)，確定對(duì)于給定CG位點(diǎn)能夠通過(guò)比對(duì)鑒定到的菌株數(shù)量（N），然后計(jì)算甲基化CG位點(diǎn)在所有菌株N中的比例(圖7D)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，與空白模型對(duì)照相比，不論作為參照菌株，還是著絲粒CG二核苷酸能夠比對(duì)到的菌株數(shù)量，共享甲基化位點(diǎn)增量顯著。

由于C. deuterogattii伴有5mC丟失和完整轉(zhuǎn)座子，因此可能如前所述，DNA甲基化主要發(fā)生在Tcn元件。作者進(jìn)一步檢測(cè)這些元件與無(wú)Tcn著絲粒序列相比，5mC的水平是否表現(xiàn)較高，并且甲基化圖譜是否保守。在所有八個(gè)菌株中，作者鑒定了著絲粒區(qū)域與Tcn1-Tcn6高度同源的序列，包括一個(gè)包含兩個(gè)LTRs的片段，將其作為候選活躍轉(zhuǎn)座子。由于其序列長(zhǎng)度以及重復(fù)性的特征，全基因組甲基化數(shù)據(jù)無(wú)法很好的覆蓋Tcn元件，因此借用Nanopore長(zhǎng)讀長(zhǎng)數(shù)據(jù)的甲基化信息對(duì)全基因組甲基化數(shù)據(jù)進(jìn)行補(bǔ)充，且發(fā)現(xiàn)與全基因組甲基化數(shù)據(jù)高度一致。跟關(guān)注的Tcn元件甲基化活性相一致，作者發(fā)現(xiàn)著絲粒上Tcn相關(guān)序列CG甲基化比例遠(yuǎn)高于非Tcn相關(guān)序列(圖7E)。

因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)Tcn3相關(guān)序列呈現(xiàn)最長(zhǎng)的中位數(shù)長(zhǎng)度和最多的LTR側(cè)翼元件，因此對(duì)其進(jìn)行深入分析。將最長(zhǎng)的Tcn3相關(guān)序列（上四分位數(shù)）的每一個(gè)CG二核苷酸與5mC數(shù)據(jù)比對(duì)。對(duì)于絕大部分比對(duì)的CG二核苷酸（圖7F，垂直列），相對(duì)于獨(dú)自5mC位點(diǎn)次序改變的Tcn3對(duì)照模型，共享甲基化比例更高（平均分?jǐn)?shù)0.7對(duì)0.4149，p<10^-16），表明菌株間5mC模式共享高于期望值。同時(shí)注意到，在一些情況下，單個(gè)菌株內(nèi)不同Tcn3元件的甲基化模式相似（圖7F），這更可能是重組的結(jié)果而非逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座，因?yàn)楹笳咄ǔＵJ(rèn)為是去除甲基化模式。小部分幾乎無(wú)甲基化修飾的Tcn3可能在某個(gè)點(diǎn)上經(jīng)歷過(guò)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座而因此消除5mC，也可能是一些不再起作用的失活元件。

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