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土壤病毒組富集及DNA提取

Enrichment and DNA Extraction of Soil Virome

韓麗麗^{1, 2, # *}，畢麗^{1, 2, #}，于丹婷^{1, 2, 3}，張麗梅^{1, 2}，賀紀正^{1, 2}

¹中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心城市與區(qū)域生態(tài)國家重點實驗室，北京；²中國科學院大學，北京；³福建師范大學，福州，福建

*通訊作者郵箱: llhan@rcees.ac.cn

摘要：病毒廣泛存在于各類生態(tài)系統(tǒng)中，是地球上數(shù)量最多的生物實體。病毒不僅影響其宿主的群落組成和進化，還可以通過裂解宿主細胞和表達輔助代謝基因等方式影響元素的生物地球化學循環(huán)。但是由于技術方法等限制，我們還缺乏對土壤病毒群落組成和生態(tài)功能的認識。本文主要介紹土壤病毒組的富集和DNA提取方法，為進一步改進土壤病毒組提取方法和進行后續(xù)深入分析提供技術參考。

關鍵詞: 土壤，病毒組，富集，病毒DNA提取

材料與試劑

1.甘氨酸緩沖液 (見溶液配方)

2.超純水

3.離心管

4.30 kDa超濾離心管

5.0.22 μm濾膜

6.DNase I (Thermo Fisher Scientific, Lithuania, EU)

7.16S rRNA引物 (27F/1492R)

8.病毒DNA提取試劑盒 (Qiagen, Hilden, Germany, catalog number: 28000-50)

9.瓊脂糖

儀器設備

1.切向流過濾系統(tǒng) (Tangential Flow Filter System, QuixStand, GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA, USA)

2.振蕩器

3.金屬浴

4.水浴鍋

5.離心機

6.凝膠電泳成像儀

實驗步驟

一.土壤病毒富集

1.稱取約500 g過2 mm篩的鮮土，總共加入約3 L的甘氨酸緩沖液 (250 mM，pH = 8.5)。

注：從樣地采回的土壤樣品放置4°C冰箱，并盡快提取土壤病毒。除甘氨酸緩沖液外，還可以使用其它的緩沖液 ( Williamson等， 2003；韓麗麗等， 2017)，例如1%檸檬酸鉀。但目前不同緩沖液對不同類型的土壤病毒組的提取效果的數(shù)據(jù)還十分有限，我們暫時還未發(fā)現(xiàn)不同緩沖液對不同土壤類型的病毒提取效果的規(guī)律。

2.充分混合土壤和緩沖液，將混合液放置于振蕩器150 rpm振蕩15 min。

3.混合液于4 °C 1500 rpm低速離心2 min。

注：此步驟離心機的轉速設置與土壤樣品的理化性質有關，可以選擇1500~3000 rpm，用于沉淀懸浮的土壤顆粒。例如有機質含量較少的沙土，可用離心速度1500 rpm；有機質含量較高的土壤，可用離心速度3000 rpm。

4.收集上清液，向土壤沉淀中繼續(xù)添加緩沖液，進行重懸浮，步驟2-3重復兩次。

5.對上清液進行切向流過濾 (TFF)，并依次通過1 mm，0.45 μm和0.22 μm的濾柱，收集透過液 (如圖1) (韓麗麗等，2017)。

圖1. TFF過濾系統(tǒng)及流程 (韓麗麗等， 2017)

6.將所有透過液通過30 kDa的超濾柱，進行濃縮并收集截留液，所得濃縮液體積應小于100 mL。

注：除TFF濃縮方法外，還可以通過超高速離心機進行密度梯度離心，濃縮土壤病毒顆粒 (Thurber等，2009)。根據(jù)所富集的對象，在離心管中加入不同密度梯度的氯化銫溶液和樣品，配平后進行超高速離心，然后謹慎收集對應的病毒顆粒層。

7.濃縮液通過0.22 μm濾膜，以去除連續(xù)過濾過程中可能帶入的雜菌污染。

8.接著以4000 x g的轉速通過30 kDa超濾離心管將濃縮液進一步濃縮至1 mL左右。

注：

a.此步驟所花時間較長，注意盡可能在4 °C下進行離心。轉速和時間的設置可根據(jù)具體土壤樣品進行調整。

b.在進行下一步之前，還可以使用超高速離心機進行氯化銫梯度離心，純化濃縮液中的病毒顆粒 (Thurber等，2009)。

9.然后用DNase I處理病毒濃縮液，于37 ℃ 孵育1 h (10 units DNaseI/500 μL)，用于去除濃縮液中游離的胞外DNA。加入EDTA至終濃度為5 mM后，65℃加熱10分鐘使DNase I失活。

10.最后利用16S rRNA PCR (引物27F/1492R) 檢測濃縮液中是否存在細菌DNA污染 (見結果與分析1)。

二.土壤病毒DNA提取

使用病毒DNA提取試劑盒提取上述第10步通過檢驗后的濃縮液中的病毒DNA。操作如下：

1.提前將Solution VP1放于水浴鍋中，55 °C加熱10 min。

2.將病毒濃縮液以200 μL體積均分至2 mL Collection Tube中，向Collection Tube加入600 μL的Solution VP1，渦旋30 s，室溫孵育5 min。

3.向每個Collection Tube中加入200 μL Solution PV2，并渦旋混勻，于4 °C下孵育5 min。

4.13000 x g離心1 min，這一步用于去除病毒濃縮液中可能存在的抑制PCR等后續(xù)反應的污染物。

5.小心轉移Collection Tube中的上清液至干凈的2.2 mL Lysate Tube中，注意轉移量不能超過700 μL，轉移過程中不干擾底部沉淀物。

6.向2.2 mL Lysate Tube中加入600 μL Solution PV3和600 μL Solution PV4，渦旋至混勻，此步驟提供適合的化學條件，為第7步驟做準備。

7.從Lysate Tube中轉移620 μL液體至Spin Filter中，13000 g離心1 min，去掉濾液，重復三次，直到Lysate Tube中所有的液體都加載過濾完畢。這一步驟是將病毒DNA綁定到Spin Filter上。

8.搖勻Solution PV5液體，向Spin Filter中加入600 μL Solution PV5，13000 g離心1 min；去掉過濾液，再向Spin Filter中加入600 μL Solution PV4，13000 g離心1 min。

9.去掉第8步驟產(chǎn)生的濾液，13000 x g離心2 min，以去除Spin Filter中存留的Solution PV5和PV4。

10.小心將Spin Filter放到干凈的1.5 mL Collection Tube中，將Collection Tube放入37 °C金屬浴中，保持約2 min，以去除可能殘留的Solution PV5和PV4。

11.向Spin Filter濾膜中心小心加入60 μL Solution PV6，靜置2 min。

12.13000 x g離心1 min，過濾液體即為病毒DNA。

結果與分析

1.土壤病毒富集步驟10，對最后的濃縮液 (1 mL) 進行16S rRNA PCR (引物27F/1492R)，如果沒有條帶，則認為沒有細菌DNA污染，反之則存在污染。

2.由于病毒基因組小，不能通過凝膠電泳的方法證明是否成功提取到了足夠的病毒DNA，可能后期還需要通過病毒DNA的全基因組擴增放大DNA的量，通常使用的全基因組擴增方法如phi29 DNA聚合酶或者其他相關PCR技術等，以達到宏病毒組上機測序的要求(Thurber等，2009)。

失敗經(jīng)驗

1.針對不同的土壤樣品，最適用的提取液可能不同。目前常用的浸提液有10%的牛肉膏，250 mM甘氨酸溶液、10 mM焦磷酸鈉和1%檸檬酸鉀溶液，可根據(jù)待土壤樣品及其理化性質選擇浸提液。

2.在進行TFF濃縮過濾時，盡量將過濾液放置于冰上，以減少病毒裂解的幾率。

3.保持實驗桌面整潔，盡量減少污染。

溶液配方

1.甘氨酸緩沖液

配置250 mM甘氨酸緩沖液并將pH調至8.5 (pH和甘氨酸緩沖液用量可根據(jù)不同土壤樣品進行調整，這可能與土壤理化性質等有關，目的是盡可能多地獲取土壤病毒顆粒。目前研究中土壤病毒富集的方法還不夠成熟)。甘氨酸緩沖液盡量在當日內用完，如需第二天使用可放置4 °C冰箱保存。

致謝

本方案主要來源于課題組先前發(fā)表的相關文章 (Han等，2017; Yu等，2018; Bi等， 2020) 以及畢業(yè)論文 (于丹婷，2018; 畢麗，2020)。相關研究得到了中國科學院戰(zhàn)略性先導專項B (XDB15020200)、國家自然科學基金 (41771289 和41571248) 等項目的資助。

參考文獻

1.畢麗. (2020). 幾種農(nóng)田土壤病毒的多樣性及潛在的生態(tài)功能. 中國科學院大學.

2. 韓麗麗，于丹婷，賀紀正. (2017). 土壤病毒生態(tài)學研究方法. 生態(tài)學報 37(6)：1749-1756.

3.于丹婷. (2018). 我國典型土壤宏病毒組特征分析. 中國科學院大學.

4.Bi, L., Yu, D. T., Du, S., Zhang, L. M., Zhang, L. Y., Wu, C. F., Xiong, C., Han, L. L. and He, J. Z. (2020). Diversity and potential biogeochemical impacts of viruses in bulk and rhizosphere soils. Environ Microbiol.

5.Han, L. L., Yu, D. T., Zhang, L. M., Shen, J. P. and He, J. Z. (2017). Genetic and functional diversity of ubiquitous DNA viruses in selected Chinese agricultural soils. Sci Rep 7: 45142.

6. Thurber, R. V., Haynes, M., Breitbart, M., Wegley, L. and Rohwer, F. (2009). Laboratory procedures to generate viral metagenomes. Nat Protoc 4(4): 470-483.

7.Williamson, K. E., Wommack, K. E. and Radosevich, M. (2003). Sampling natural viral communities from soil for culture-independent analyses. Appl Environ Microbiol 69(11): 6628-6633.

8.Yu, D. T., Han, L. L., Zhang, L. M. and He, J. Z. (2018). Diversity and Distribution Characteristics of Viruses in Soils of a Marine-Terrestrial Ecotone in East China. Microb Ecol 75(2): 375-386.