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反芻動物瘤胃樣品采集與保存

Collection and Preservation of Ruminant Microbial Samples

張小麗^{1, 2}，王祚^{1, 3}，周傳社¹，焦金真^1, *，譚支良¹

¹中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，畜禽養(yǎng)殖污染控制與資源化技術國家工程實驗室，動物營養(yǎng)生理和代謝過程湖南省重點實驗室，長沙，湖南；²中國科學院大學，北京； ³湖南農業(yè)大學動物科學技術學院，長沙，湖南

*通訊作者郵箱：jjz@isa.ac.cn

摘要：反芻動物是農業(yè)部提倡養(yǎng)殖的節(jié)糧型動物，其瘤胃是自然界最完美的天然發(fā)酵罐，具備利用纖維飼料的優(yōu)勢。反芻動物瘤胃的研究不僅是對其營養(yǎng)代謝研究是必要的，對于綠色養(yǎng)殖更是至關重要的。因此采集瘤胃樣品及保存是反芻動物相關研究人員必備的操作技術(王祚，2018; Xue et al., 2020) 。瘤胃樣本的類型較多，其采集流程和操作方法對樣本后續(xù)的相關實驗結果有直接的影響，亟需將其標準化以保證實驗結果的準確性及可靠性。本文就常見胃管法采集瘤胃樣品和屠宰后采集瘤胃樣品方法及保存分別進行概述。同時，根據(jù)不同的研究目的，對采集得到的樣品進行前處理，得到幾種重要的樣本類型并保存，為規(guī)范實驗操作，提高后續(xù)工作的科學性、可比性提供依據(jù)。

關鍵詞：反芻動物，瘤胃，微生物，發(fā)酵功能，樣品采集，保存

材料與試劑

1.實驗動物

2.瘤胃液采集管（圖一）或手術器械一套

3.水盆

4.凡士林

5.錫箔紙

6.燒杯

7.紗布

8.超純水

9.生理鹽水

10.移液槍及配套槍頭

11.離心管

12.鑷子

13.液氮

儀器設備

1.天平

2.高壓滅菌鍋

3.高速離心機

4.-80 °C超低溫冰箱

實驗步驟

1.胃管法采集瘤胃液 （Wang et al., 2016）

1.1實驗動物的固定及插管

為限制實驗動物的活動范圍，首先將其固定于限位籠中，采樣人員站在右側，左手控制口腔開合，壓住實驗動物的舌頭，同時使其頭部向上傾斜，右手將外殼為不銹鋼彈性軟管 (內部為透明乳膠管，如圖1) 的瘤胃液采樣管 (提前高溫消毒后涂上一些凡士林，起到潤滑的作用) 伸入實驗動物的口腔中，沿著舌頭將采集管送至咽喉部位并經(jīng)過食道，當采集管的另一端能明顯聞到瘤胃液的氣味且實驗動物的呼吸順暢說明采集管已抵達瘤胃腹囊。

圖1. 瘤胃液采集管. 可根據(jù)實驗動物的大小進行型號的選擇，一般成年?？蛇x擇長度為1,800 mm，直徑為18 mm的采集管；羊或犢牛等小型反芻動物選擇長度為1,200 mm，直徑為8 mm的采集管

1.2瘤胃樣品的采集

本方法的原理是利用采集管接觸到瘤胃的腹囊，同時利用負壓，將腹囊中的內容物吸出腹囊。

待采集管到達瘤胃腹囊后將大容量注射器 (100 - 200 mL) 與采樣管后方連接好，抽動大容量注射器即可抽取瘤胃內容物。如若管內空氣較多，可先排出空氣后捏住或者折疊乳膠管使之不漏氣，然后再利用大容量注射器進行抽取胃液。

1.3拔出胃管

采集完畢后，采集管向地面傾斜，防止拔管過程中采集管里殘留的瘤胃液流入氣管，隨后將采集管緩慢抽出，并放置在盛有蒸餾水的盆中，溫水反復換水沖洗采集管和注射器。

1.4樣品保存

根據(jù)實驗目的將得到的瘤胃液分成兩部分保存。一部分用注射器將采集的瘤胃液注射入10 mL滅菌離心管中，液氮速凍，之后保存在-80°C超低溫冰箱。這部分樣本可以用于提取核酸進行后續(xù)擴增子測序、宏基因組及宏轉錄組等分析。另一部分用于測定瘤胃液中發(fā)酵功能指標（揮發(fā)性脂肪酸、氨氮、代謝產物等）的樣品，先注射入10 mL滅菌離心管中，然后15,000 g，4°C離心10 min。取3 mL上清加入含有0.3 mL 25%偏磷酸溶液的離心管中，上下顛倒混勻。放入-20°C保存?zhèn)溆谩?/span>

1.5注意事項

為了避免瘤胃液采集管插入的深度和位置而對樣品產生偏差，整個試驗期瘤胃液采樣人員為固定人員，或是在采集軟管另一端做一個記號，保證每次到了這個地方就停止往里送。同時為避免最初采集的瘤胃液中包含口腔唾液，食管中的消化道黏膜分泌物以及殘留在采集管內的蒸餾水，丟棄最初收集的100 mL瘤胃液，隨后抽取的瘤胃液才作為后續(xù)試驗的樣品。

2.屠宰后瘤胃液樣品采集

2.1屠宰前準備

將手術器械、錫箔紙、紗布、燒杯、槍頭等器材在高壓滅菌鍋中進行滅菌處理。

2.2屠宰及采樣部位的選取

按照相關動物委員會的規(guī)定進行人道主義屠宰，確定其死亡后，立即打開腹腔，取出整個瘤胃，按照如圖2所示，找到采樣的最佳位置 (背囊、腹囊、背盲囊和腹盲囊) (吳禮平，2017) ，迅速從四個地方取出瘤胃內容物放于大燒杯中，充分混合后根據(jù)樣品的需求，按照下文采樣類型進行后續(xù)處理保存；

圖2. 瘤胃示意圖. 左：1.食管2.脾3.左縱溝4.瘤胃背囊5.背冠狀溝6.后背盲囊7.后溝8.后腹盲囊9.腹冠狀溝10.瘤胃腹囊11.前腹盲囊12.皺胃13.前溝14.網(wǎng)胃15.瘤網(wǎng)溝16.前背盲囊；右：1.后背盲囊2.背冠狀溝3.瘤胃背囊4.右縱溝5.脾6.食管7.網(wǎng)胃8.瓣胃9.皺胃10.十二指腸11.瘤胃腹囊12.腹冠狀溝13.后腹盲囊14.后溝

2.3采樣類型、樣品處理及保存 (王祚，2018)

1)瘤胃液相樣品

首先將錫箔紙包裹住250 mL燒杯并貼實壓緊，將混合均勻的瘤胃內容物倒入燒杯中大約至150 mL刻度處。然后使用咖啡按壓活塞 (Bodum Inc., Triengen, Switzerland) 輕輕擠壓過濾 (如圖3) ，濾液立即測定pH，接著使用移液槍分兩次取出4 mL過濾得到的液體打入10 mL滅菌離心管中，然后再將離心管放入液氮使樣品迅速凍結后，立即將樣品放入?80 °C保存，此樣品可用于提取核酸進行后續(xù)轉錄組、代謝組以及宏基因組等分析。

圖3. 咖啡按壓活塞

再次使用移液槍取出4 mL過濾得到的液體打入10 mL滅菌離心管中，15,000 g，4°C離心10 min。取3 mL上清加入含有0.3 mL 25%偏磷酸溶液的離心管中，上下顛倒混勻（此步驟的目的是固定液相中容易揮發(fā)的物質）。放入-20°C保存（盡快測定），此樣品可以用于瘤胃液中揮發(fā)性脂肪酸以及氨氮等發(fā)酵指標的分析。

2)瘤胃固相樣品

咖啡按壓活塞法：使用咖啡按壓活塞盡可能地擠出剩余的液體，使用鑷子分兩次在活塞中央處夾取5 g固體放入天平上的錫箔紙中，然后再將錫箔紙放在液氮表面使其速凍，將樣品用錫箔紙包裹壓實后放入-80°C保存?zhèn)溆谩?/span>

四層紗布法：將醫(yī)用無菌紗布疊成四層，把混合均勻的瘤胃內容物倒在四層紗布上，用手卷起紗布邊緣，完全包裹內容物后盡量擠出液體，使用鑷子分兩次在紗布中央處夾取5 g固體放入天平上的錫箔紙中，然后再將錫箔紙放在液氮表面使其速凍，將樣品用錫箔紙包裹壓實后放入-80°C保存?zhèn)溆谩?/span>

兩種方法各有優(yōu)點，前者固液分離更加徹底，同時相對穩(wěn)定，后者成本低，同時操作簡便。

3)瘤胃上皮樣品

取新鮮瘤胃上皮 (背囊、腹囊、背盲囊和腹盲囊) ，用預冷的無菌生理鹽水沖洗去除飼料顆粒以及未附著微生物之后，剝離去掉肌肉層得到瘤胃上皮，將不同位置分3次剪取2 g左右 (大約4 cm²) 的上皮組織，用錫箔紙包裹好經(jīng)液氮速凍后，保存在-80 °C備用。

致謝

感謝國家自然科學基金委國際 (地區(qū)) 合作與交流項目 (31320103917) 和重點項目(31730092) 對本實驗流程的資助。胃管法采集瘤胃液改自Wang et al., (2016)，屠宰后樣品采集改自王祚 (2018)，特此致謝。

參考文獻

1.王祚 (2018) 山羊瘤胃發(fā)育過程中甲烷菌與細菌定植演變及其調控.中國科學院大學博士論文.

2.吳禮平 (2017) 牛 (羊) 的胃、腸、肝、胰解剖結構. 云端獸醫(yī).

3.Wang M, Wang R, Xie TY, et al. (2016), Shifts in rumen fermentation and microbiota are associated with dissolved ruminal hydrogen concentrations in lactating dairy cows fed different types of carbohydrates. J Nutr. 146(9): 1714-1721.

4.Xue MY, Sun HZ, Wu XH et al. (2020) Multi-omics reveals that the rumen microbiome and its metabolome together with the host metabolome contribute to individualized dairy cow performance. Microbiome 8, 64.