CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)已成為合成生物學(xué)創(chuàng)新的典范，但它具有一些主要局限性。 可以對(duì)CRISPR-Cas9進(jìn)行編程，以發(fā)現(xiàn)和切割特定的DNA片段，但是編輯DNA以產(chǎn)生所需的突變需要誘使細(xì)胞使用新的DNA片段來(lái)修復(fù)斷裂。 這種誘餌轉(zhuǎn)換可能很復(fù)雜，甚至可能對(duì)細(xì)胞有毒，因?yàn)镃as9經(jīng)常還會(huì)切割意外的脫靶位點(diǎn)。

替代基因編輯技術(shù)稱為重組，而是通過(guò)在細(xì)胞復(fù)制其基因組時(shí)引入另一種DNA來(lái)執(zhí)行這種誘餌轉(zhuǎn)換，從而有效地產(chǎn)生基因突變而不會(huì)破壞DNA。 這些方法非常簡(jiǎn)單，可以立即在許多細(xì)胞中使用，以創(chuàng)建復(fù)雜的突變庫(kù)，供研究人員進(jìn)行研究。 但是，要弄清楚這些突變的作用是什么，就需要對(duì)每個(gè)突變體進(jìn)行分離，測(cè)序和表征：這是一項(xiàng)耗時(shí)且不切實(shí)際的任務(wù)。

哈佛大學(xué)和哈佛醫(yī)學(xué)院（HMS）的Wyss生物啟發(fā)工程研究所的研究人員創(chuàng)建了一種名為Retron Library Recombineering（RLR）的新基因編輯工具，該工具使這項(xiàng)任務(wù)變得更加容易。  RLR同時(shí)生成多達(dá)數(shù)百萬(wàn)個(gè)突變，并對(duì)突變細(xì)胞進(jìn)行“條形碼”，以便可以一次篩選整個(gè)庫(kù)，從而可以輕松生成和分析大量數(shù)據(jù)。 在PNAS中的最新論文中描述了在細(xì)菌細(xì)胞中已經(jīng)實(shí)現(xiàn)的這一成就。

共同第一作者說(shuō)：“ RLR使我們能夠進(jìn)行CRISPR不可能完成的工作：我們隨機(jī)切碎了一個(gè)細(xì)菌基因組，將這些基因片段原位轉(zhuǎn)化為單鏈DNA，并利用它們同時(shí)篩選了數(shù)百萬(wàn)個(gè)序列?！?馬克斯·舒伯特（Max Schubert）博士，Wyss核心學(xué)院成員喬治·丘奇（George Church）博士后實(shí)驗(yàn)室。  “ RLR是一種更簡(jiǎn)單，更靈活的基因編輯工具，可用于高度多重實(shí)驗(yàn)，從而消除了CRISPR經(jīng)常觀察到的毒性，并提高了研究人員在基因組水平上探索突變的能力?！?/p>

回顧：從謎題到工程工具

逆轉(zhuǎn)錄是細(xì)菌DNA的片段，它們經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單鏈DNA（ssDNA）的片段。  Retrons的存在已有數(shù)十年之久，但他們產(chǎn)生的ssDNA的功能卻從1980年代一直持續(xù)到2020年6月，當(dāng)時(shí)一個(gè)團(tuán)隊(duì)終于弄清了ssDNA能夠檢測(cè)出病毒是否感染了細(xì)胞，從而構(gòu)成了細(xì)菌免疫的一部分。 系統(tǒng)。

雖然逆轉(zhuǎn)錄原本只是簡(jiǎn)單地視為細(xì)菌的一個(gè)怪癖，但研究人員在過(guò)去幾年中對(duì)它們?cè)絹?lái)越感興趣，因?yàn)樗鼈兿馛RISPR一樣，可以用于細(xì)菌，酵母菌甚至人類細(xì)胞中的精確而靈活的基因編輯。

“很長(zhǎng)一段時(shí)間以來(lái)，CRISPR一直被認(rèn)為是細(xì)菌所做的一件奇怪的事情，并且弄清楚如何利用它進(jìn)行基因組工程改變了世界。逆轉(zhuǎn)錄是另一種細(xì)菌創(chuàng)新，也可能會(huì)提供一些重要的進(jìn)步，” Schubert說(shuō)。 由于其在細(xì)菌中產(chǎn)生ssDNA的能力，幾年前激起了他對(duì)Retron的興趣-這是一種在稱為寡核苷酸重組的基因編輯過(guò)程中使用的引人注目的功能。

基于重組的基因編輯技術(shù)需要將包含所需突變的ssDNA整合到生物體的DNA中，這可以通過(guò)以下兩種方式之一完成。 可在修復(fù)過(guò)程中對(duì)雙鏈DNA進(jìn)行物理切割（例如，使用CRISPR-Cas9）以誘導(dǎo)細(xì)胞將突變序列整合到其基因組中，或者將突變DNA鏈和單鏈退火蛋白（SSAP） 將其引入正在復(fù)制的細(xì)胞中，以便SSAP將突變鏈整合到子細(xì)胞的DNA中。

“我們認(rèn)為逆轉(zhuǎn)錄應(yīng)該使我們能夠在我們想要編輯的細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ssDNA，而不是試圖將它們從外部強(qiáng)迫進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而又不會(huì)破壞天然DNA，這兩個(gè)都是非常引人注目的品質(zhì)，”研究人員說(shuō)。 第一作者丹尼爾·古德曼（Daniel Goodman）博士，曾任威斯研究所（Wyss Institute）研究生院研究員，現(xiàn)為UCSF的簡(jiǎn)·科芬·Childs博士后研究員。

逆轉(zhuǎn)錄的另一個(gè)吸引人之處是它們的序列本身可以用作“條形碼”，以識(shí)別細(xì)菌池中的哪些個(gè)體已接收到每個(gè)逆轉(zhuǎn)錄序列，從而可以顯著更快地匯總篩選精確創(chuàng)建的突變菌株。

為了了解他們是否真的可以使用逆轉(zhuǎn)錄來(lái)實(shí)現(xiàn)與逆轉(zhuǎn)錄的有效重組，Schubert和他的同事首先創(chuàng)建了細(xì)菌DNA的環(huán)狀質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含位于逆轉(zhuǎn)錄序列中的抗生素抗性基因，以及一個(gè)SSAP基因，可以將逆轉(zhuǎn)錄序列整合入 細(xì)菌基因組。 他們將這些逆轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒插入到大腸桿菌中，以查看在20代細(xì)胞復(fù)制后該基因是否成功整合到其基因組中。 最初，少于0.1％的帶有逆轉(zhuǎn)錄重組系統(tǒng)的大腸桿菌摻入了所需的突變。

為了改善這種令人失望的初始性能，研究小組對(duì)細(xì)菌進(jìn)行了幾項(xiàng)基因調(diào)整。 首先，他們使細(xì)胞的天然錯(cuò)配修復(fù)機(jī)制失活，該機(jī)制糾正了DNA復(fù)制錯(cuò)誤，因此可以在將其遺傳給下一代之前“固定”所需的突變。 他們還使編碼外切核酸酶的兩個(gè)細(xì)菌基因失活-破壞自由浮動(dòng)的ssDNA的酶。 這些變化極大地增加了整合逆轉(zhuǎn)錄序列的細(xì)菌比例，達(dá)到了人口總數(shù)的90％以上。

突變體的名稱標(biāo)簽

既然他們確信自己的逆轉(zhuǎn)錄ssDNA已整合到細(xì)菌的基因組中，該團(tuán)隊(duì)就測(cè)試了他們是否可以將逆轉(zhuǎn)錄用作基因測(cè)序的“捷徑”，從而可以在混合物中進(jìn)行許多實(shí)驗(yàn)。 因?yàn)槊總€(gè)質(zhì)粒都有自己獨(dú)特的反轉(zhuǎn)錄序列，可以充當(dāng)“名稱標(biāo)簽”，他們認(rèn)為它們應(yīng)該能夠?qū)Χ痰枚嗟姆崔D(zhuǎn)錄序列進(jìn)行測(cè)序，而不是對(duì)整個(gè)細(xì)菌基因組進(jìn)行測(cè)序，從而確定細(xì)胞已接受了哪些突變。

首先，研究小組測(cè)試了RLR是否可以檢測(cè)到大腸桿菌中已知的抗生素耐藥性突變。 他們發(fā)現(xiàn)，與其他突變相比，包含這些突變的序列在測(cè)序數(shù)據(jù)中的占比要高得多。 研究小組還確定，RLR具有足夠的靈敏度和精確度，可以測(cè)量由非常相似的突變引起的耐藥性的微小差異。 至關(guān)重要的是，通過(guò)對(duì)整個(gè)細(xì)菌庫(kù)中的條形碼進(jìn)行測(cè)序而不是對(duì)單個(gè)突變體進(jìn)行分離和測(cè)序來(lái)收集這些數(shù)據(jù)，可以極大地加快這一過(guò)程。

然后，研究人員又將RLR向前走了一步，看看它是否可以用于隨機(jī)片段化的DNA，并找出它們一次可以使用多少個(gè)逆轉(zhuǎn)錄。 他們切碎了對(duì)另一種抗生素具有高度抵抗力的大腸桿菌菌株的基因組，并利用這些片段建立了包含在質(zhì)?；厮菪蛄兄械臄?shù)千萬(wàn)條基因序列的文庫(kù)。  “ RLR的簡(jiǎn)單性在本實(shí)驗(yàn)中確實(shí)得到了體現(xiàn)，因?yàn)樗刮覀兡軌蚪⒁粋€(gè)比我們目前可用于CRISPR的庫(kù)更大的庫(kù)，在該庫(kù)中我們必須合成指導(dǎo)基因和供體DNA序列才能誘導(dǎo)每個(gè)突變，” 舒伯特說(shuō)。

然后將該文庫(kù)引入RLR優(yōu)化的大腸桿菌菌株中進(jìn)行分析。 研究人員再一次發(fā)現(xiàn)，通過(guò)對(duì)細(xì)菌庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，它們相對(duì)于其他細(xì)菌富集的事實(shí)可以很容易地識(shí)別出賦予抗生素抗藥性的逆轉(zhuǎn)錄病毒。

高級(jí)作者喬治說(shuō)：“能夠利用RLR分析合并的條形碼突變庫(kù)，可以同時(shí)進(jìn)行數(shù)百萬(wàn)次實(shí)驗(yàn)，使我們能夠觀察到整個(gè)基因組突變的影響，以及這些突變之間如何相互作用?！?丘奇（Church）領(lǐng)導(dǎo)威斯研究所（Wyss Institute）的合成生物學(xué)重點(diǎn)領(lǐng)域，同時(shí)還是HMS的遺傳學(xué)教授。  “這項(xiàng)工作有助于建立在其他遺傳系統(tǒng)中使用RLR的路線圖，這為未來(lái)的遺傳研究開(kāi)辟了許多令人興奮的可能性?！?/p>

RLR與CRISPR區(qū)別的另一個(gè)特征是，隨著細(xì)菌的復(fù)制，成功將所需突變整合到其基因組中的細(xì)菌比例會(huì)隨著時(shí)間的推移而增加，而CRISPR的“單發(fā)”方法在首次嘗試時(shí)往往會(huì)成功或失敗。 RLR可能與CRISPR結(jié)合使用以改善其編輯性能，或者可以在CRISPR有毒性的許多系統(tǒng)中用作替代方法。

在RLR上還有更多工作要做，以提高和標(biāo)準(zhǔn)化編輯率，但是對(duì)于這種新工具的興趣正在增長(zhǎng)。  RLR簡(jiǎn)單，流線型的性質(zhì)可以研究多個(gè)突變?nèi)绾蜗嗷ビ绊?，并生成大量?shù)據(jù)點(diǎn)，從而可以使用機(jī)器學(xué)習(xí)來(lái)預(yù)測(cè)進(jìn)一步的突變效應(yīng)。

Wyss研究所創(chuàng)始主任Don Ingber博士說(shuō)：“這種新的合成生物學(xué)工具將基因組工程提高到更高的通量水平，這無(wú)疑將帶來(lái)新的，令人興奮的和意想不到的創(chuàng)新?！? Ingber還是HMS和波士頓兒童醫(yī)院的Judah Folkman血管生物學(xué)教授，還是哈佛大學(xué)約翰·保爾森工程與應(yīng)用科學(xué)學(xué)院的生物工程學(xué)教授。

該論文的其他作者包括HMS的Timothy Wannier，華威大學(xué)的Divjot Kaur，麻省理工學(xué)院的Fahim Farzadfard和Timothy Lu，以及Gladstone數(shù)據(jù)科學(xué)和生物技術(shù)學(xué)院的Seth Shipman。

這項(xiàng)研究得到了美國(guó)能源部（DE-FG02-02ER63445）和國(guó)防科學(xué)與工程研究生獎(jiǎng)學(xué)金的支持。