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生物技術(shù)和IT很像，是“軟件”和“硬件”共同作用。硬件是各種儀器和設備平臺，軟件則是各種酶和技術(shù)。同樣和IT行業(yè)一樣，硬件創(chuàng)新可能需要綜合的團隊，軟件創(chuàng)新開發(fā)一個程序或者APP可能只需要一個人，但依然可以產(chǎn)生顛覆性的革命。無疑DNA聚合酶是分子生物學中最重要的酶，沒有之一。所以現(xiàn)在簡單說一下DNA聚合酶在NGS中的應用起源。

DNA聚合酶分為常溫酶和PCR酶

常溫酶有大腸桿菌DNA 聚合酶I 、T4 DNA聚合酶等。大腸桿菌DNA 聚合酶I 經(jīng)過枯草桿菌蛋白酶處理后，酶分子分裂成兩個片段，大片段分子量為76KD，通常稱為Klenow fragment，小片段的分子量為34KD，稱為Klenow (3’-5’ exo-) 。在NGS文庫構(gòu)建時，通常用Klenow fragment和T4 DNA聚合酶組合進行片段化后的DNA末端修飾。當然，如果是物理打斷，末修體系中還要加入PNK修復斷裂的磷酸基團。采用one-tube的建庫方法，直接在體系加入taq DNA聚合酶一步完成末修加A，三步法則需要純化，用Klenow (3’-5’ exo-)加A。

phi29 DNA聚合酶也是NGS用的較多，在單細胞基因組擴增中早期都是用它，無論是MDA、還是謝曉亮老師的MALBAC的方法。直到2017年，謝曉亮組發(fā)表的LIANTI方法，才替換了這個酶，用的是帶T7啟動子的Tn5轉(zhuǎn)座子打斷，然后用T7啟動子體外線性擴增。

還有其它不同DNA聚合酶也有使用，比如Bst聚合酶，該酶具有很強的鏈置換能力，最適溫度是65°C，常用于LAMP檢測（環(huán)介導等溫擴增反應）。而且，llumina測序儀在X Ten使用RPA技術(shù)之前，簇生成技術(shù)用的橋式PCR就是交替使用Bst聚合酶進行延伸反應以及使用甲酰胺（formamide）進行變性反應。

當然最重要還是PCR酶。PCR酶是耐熱DNA聚合酶，分為兩種普通耐熱DNA聚合酶，以Taq酶為代表，PCR產(chǎn)物有A尾；高保真DNA聚合酶，以pfu DNA 聚合酶和KOD為代表。高保真的DNA聚合酶具有3'-5'外切酶活性可以消除錯配，PCR產(chǎn)物為平末端。

目前NGS文庫構(gòu)建，即使普通的高保真DNA聚合酶都很少使用。因為在文庫覆蓋度、模板偏好性、GC bias等NGS文庫對PCR酶有著最高要求，若非經(jīng)過千錘百煉的酶難以勝任。

當然，分子生物學的發(fā)展，也包含著PCR酶的發(fā)展：

1973年，臺灣科學家錢嘉韻，發(fā)現(xiàn)了穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶，為PCR技術(shù)發(fā)展也做出了基礎性貢獻。由1983年美國Mullis首先提出設想，1985年P(guān)CR技術(shù)的真正誕生。

PCR相關(guān)專利一直是個巨大的搖錢樹。話說當年Roche以30億美元的天價收購了Mullis所在的Cetus公司以及PCR專利，可是當時Cetus還和當時的Perkin Elmers公司合作開發(fā)PCR儀器，所以部分PCR專利依然被堅持牢牢控制在PE公司手里（后來PE和ABI分分合合中，落入ABI手里）。至于PCR酶，盡管Roche在美國的天然Taq專利無效（見Nature 402, 709; 1999），羅氏公司仍然擁有重組版的Taq專利。

羅氏和賽默飛一直是PCR技術(shù)的領(lǐng)導者。當然PCR酶領(lǐng)域其它公司有不可忽視的貢獻。Stratagene的Pfu酶一向都是研究人員心目中最好的高保真酶，2007年6月安捷倫科技(Agilent Technologies ) 收購了Stratagene后，也歸入安捷倫名下。KOD是從鹿兒島縣小寶島的含硫氣孔中分離出來的超嗜熱原始菌Thermococcus kodakaraensis ，1995年 KOD上市后始終是東洋紡的拳頭產(chǎn)品，就連賽默飛著名的Pfx DNA聚合酶也是一種從Thermococcus 菌株KOD中克隆得到的專利重組DNA聚合酶。

1996年美國ABI公司（或者說PE公司，這兩個公司分分合合，有多年糾葛）研究出實時熒光定量PCR技術(shù)。該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍, 而且采用了完全閉管檢測, 不需PCR后處理, 避免了交叉污染。配以相應的熒光PCR儀, 整個PCR過程可實現(xiàn)自動化, 且耗時短, 操作方便, 較之傳統(tǒng)的定量方法勞動強度小, 易于標準化和推廣應用. 因而迅速在醫(yī)學, 檢驗檢疫, 軍事, 農(nóng)業(yè), 科研等領(lǐng)域得到了推廣應用。一開始的非特異性檢測擴增序列的代表是SYBR Green I熒光染料。SYBR Green I只與DNA雙鏈結(jié)合，插入DNA雙鏈時發(fā)出熒光；DNA雙鏈解鏈時釋放出來，熒光信號急劇減弱。在一個加入過量SYBR green 1熒光染料的體系內(nèi)，其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。熒光染料的優(yōu)勢在于能監(jiān)測各種雙鏈DNA序列的擴增，無需設計探針，檢測簡單簡便，成本低廉。然而正是由于熒光染料能和任何dsDNA結(jié)合，對DNA模板沒有選擇性，因此它也能與非特異的dsDNA（如引物二聚體）結(jié)合，使實驗容易產(chǎn)生假陽性信號，引物二聚體的問題目前可以用帶有熔解曲線（melting curve）分析的軟件加以解決。所以DNA聚合酶對于定量PCR反應保持特異性的重要作用，ABI采用化學修飾Taq酶得到高度嚴謹?shù)臒釂覶aq，從而有效減少了非特異擴增，提高熒光染料法做定量PCR的特異性。這就是當年著名的ABI的“金牌”酶：AmpliTaq Gold? DNA Polymerase。AmpliTaq Gold如其名，確確實實是ABI定量PCR試劑中的一塊金字招牌。AmpliTaq Gold通過對Taq酶的修飾確保在95℃才激活，根本上防止了反應前非特異性擴增。AmpliTaq Gold對Thermus aquaticus Taq DNA polymerase進行化學修飾改造-通過這種改造，修飾成份可以封閉AmpliTaq活性位點，在95℃之后，這種修飾成份也就從AmpliTaq上釋放出來，還原AmpliTaq擴增活性。這樣就確保了DNA在完全解鏈的情況下才會開始PCR擴增反應。Qiagen的HotStarTaq也進行了相似的改造。

順便說一下，SYBR Green的非特異問題，當然不是只有一條途徑。所謂條條道路通羅馬，不同于Qiagen或者ABI利用的是提高DNA聚合酶的特異性，“曲線救國”，Invitrogen公司采用直接改造SYBR Green的方法，發(fā)展出更特異更靈敏的熒光染料——SYBR? GreenER? qPCR Reagent System。SYBR Green原屬于Molecular Probes公司的專利，但隨著Probes被并購進入Invitrogen。

如果說金牌酶是第一代工程酶的話，Phusion高保真酶就是第二代工程酶的典范產(chǎn)品。

Finnzymes公司（現(xiàn)已被賽默飛世爾科技收購）獨辟蹊徑，將雙鏈DNA結(jié)合蛋白（紫色）與一種新型的具有校對功能的類熱球菌酶（綠色）融合，形成了一種獨特的高性能聚合酶——Phusion? DNA聚合酶。聚合酶與Sso7d DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合，從而改善了保真度、速度和性能可靠性。

在Finnzymes公司沒有被收購之前，Phusion由Finnzymes公司開發(fā)和生產(chǎn)，NEB來銷售。2010年Finnzymes被賽默飛收購，歸入旗下。2012年NEB推出Q5超高保真DNA聚合酶，它與Phusion類似，也是聚合酶與Sso7d DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合。伯樂推出過類似的酶。

與常規(guī)的化學修飾或抗體熱啟動不同，Phusion熱啟動利用了一種獨特的適體（aptamer）。這種分子通過非共價相互作用與聚合酶可逆結(jié)合，在室溫狀態(tài)下阻斷其活性；進入循環(huán)過程后，一旦到達高溫，適體就會立即脫落，DNA聚合酶激活。Phusion熱啟動版本不需要像金牌酶一樣開始的時候要單獨熱啟動10 min。

高保真酶的一個主要弱點是產(chǎn)量偏低，一個重要原因是在PCR過程中由于dCTP脫氨基生成dUTP，dUTP的累積會造成所謂'PCR poisoning'，抑制PCR反應，也阻礙高保真酶的校正功能，從而限制了酶的精確度和延伸模版的能力。Stratagene添加ArchaeMaxx?聚合酶增強因子，能將dUTP分解為無毒的dUMP和焦磷酸，從而解除dUTP累積造成的影響，可以顯著提高產(chǎn)量、減少擴增時間并可擴增更長的模板。

在PCR buffer的配方也是有更多的改進，TMAC、甜菜堿、新材料新化合物PCR添加劑等層出不窮，甚至復合型PCR添加劑，極大地提高DNA聚合酶的性能,，降低GC bias。然而，目前生物醫(yī)藥領(lǐng)域所使用的大部分生物酶都只是天然存在形式，即使有些酶經(jīng)過基因工程改造，但是由于酶分子自身的結(jié)構(gòu)和功能限制，要想得到真正滿足科研工作人員需要的產(chǎn)品，卻是一件費時費力的事情，而且常常達不到預期的要求。

正是因為如此，Kapa公司（被羅氏收購）利用“直接進化（directed evolution technology platform）”的專利技術(shù)平臺上來篩選和生產(chǎn)高品質(zhì)的生物酶，異軍突起，生產(chǎn)了新一代的PCR酶。

直接分子進化又叫高通量分子進化（High-throughput Molecular Evolution），是運用遺傳，基因工程，生物信息學等技術(shù)來在分子水平上設計真正滿足不同實際要求的生物酶。無論是自己的體驗，還是各種文獻的報道，kapa HiFi Hot start Ready mix一直是最好的NGS文庫構(gòu)建酶。Kapa 2G Fast Multiplex也是一種經(jīng)濟高效的多重PCR文庫構(gòu)建酶，在遺傳突變檢測應用最為廣泛，不過在檢測低頻突變時，更推薦Qiagen的那款。

DNA聚合酶的進化，還在繼續(xù)。Kapa、賽默飛公司等仍在運用基因工程的手段改造DNA聚合酶，篩選更好的酶。另一方面，科學家在自然界也會找到更多新穎的DNA聚合酶，如NEB 公司的 Vent 和 Deep Vent DNA聚合酶系列，兩者都是從海底火山口分離出來后克隆的，是普通 Taq 酶耐熱性的三倍以上；華中科大在深?；鹕降牟《局械谝粋€不需要引物的DNA聚合酶……從Taq酶起，一些極端環(huán)境就是盛產(chǎn)精品，我們有理由相信以后會發(fā)現(xiàn)更多驚喜。