【原】細胞系建好了，表型實驗實驗怎么做？

生物學渣 2021-05-25

展開全文

我相信，同為科研淪落人的你，一定知道只要做了基因編輯細胞株的構(gòu)建，無論是細胞敲除、敲入，還是點突變、穩(wěn)轉(zhuǎn)株，都難以逃脫要檢測細胞表型的命運。畢竟你構(gòu)建的細胞系連想要的表型都沒有，是很難有底氣投高分文章的。只是，這么多種細胞表型，哪些表型服務檢測搭配在一起會更好？做細胞凋亡檢測是不是也要檢測細胞周期？每種細胞表型都有幾種檢測方法，要選哪個？

先別急，大部分細胞（尤其是腫瘤細胞）表型研究都離不開細胞增殖、細胞毒性、細胞周期、細胞遷移/侵襲和細胞凋亡這幾種表型分析，把這幾種表型分析的原理和用途弄明白也許就知道答案了！

1、細胞增殖

細胞增殖（cell proliferation）是生物體生長、發(fā)育、繁殖以及遺傳的基礎。通過對比不同細胞組別的生長曲線，比如野生型VS突變體、對照VS過表達、對照VS敲降等等來判斷所構(gòu)建的細胞系的增殖狀態(tài)是否有顯著差異，進而可以選擇進行細胞周期或細胞凋亡的檢測，如圖1呈現(xiàn)的是過表達p62對U87和U251細胞系增殖的影響。

檢測細胞增殖的方法有很多，其中常用的是CCK-8檢測法和活細胞計數(shù)法。計數(shù)法不必多說，科研人必備技能，而CCK-8檢測法是利用正常細胞的線粒體內(nèi)含有的琥珀酸脫氫酶可將四唑鹽類物質(zhì)還原為紫色結(jié)晶狀物質(zhì)的原理，當這些紫色物質(zhì)沉積在細胞周圍，可以通過酶標儀讀取450nm OD值（optical density），從而檢測細胞增殖狀態(tài)。其他方法如BrdU染色法和Ki-67檢測法，可以反映出增殖細胞的空間分布，但只能捕獲單一時間點的增殖細胞比例，因此一般用于檢測組織切片的細胞增殖。

圖1

2、細胞周期

通常，在發(fā)現(xiàn)細胞增殖有差異后，可以通過檢測細胞周期來找出產(chǎn)生差異的原因，比如S、G2和/或M期的細胞減少，而大多數(shù)細胞停滯在G1期，那就說明可能是G1/S檢驗點出現(xiàn)了異常，這對研究深入了解生物的生長發(fā)育和控制腫瘤生長等有重要意義。細胞周期的檢測方法是簡便直觀的碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）染色-流式分析法。

碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)與雙鏈DNA結(jié)合后可以產(chǎn)生熒光，并且熒光強度和雙鏈DNA的含量成正比，因此可以用流式細胞儀對細胞進行DNA含量測定，由于細胞周期各時相的DNA含量不同，根據(jù)DNA含量的分布情況，可以將細胞周期各時相區(qū)分為G1/G0期、S期和G2/M期，獲得的流式直方圖對應的各細胞周期可通過特殊軟件計算各時相的細胞百分率（圖2），進而分析細胞周期是否正常。

圖2

3、細胞凋亡

細胞凋亡是多基因嚴格控制的過程，這些基因在種屬之間非常保守，如Bcl-2家族、Caspase家族、抑癌基因P53等。凋亡過程的紊亂可能與許多疾病的發(fā)生有直接或間接的關系，如腫瘤和自身免疫性疾病等，因此如果你是研究腫瘤或退行性疾病，細胞凋亡的檢測往往是必要的，因為這一指標將會成為后續(xù)機制研究的風向標。

由于細胞凋亡的過程有典型的形態(tài)和分子層面的變化，檢測方法也是多樣的，常用的有Annexin V/PI雙染法、TUNEL檢測法和Caspase-3活性檢測法。其中，Annexin V/PI雙染法因其可區(qū)分凋亡早期和晚期和方便量化而被廣泛使用。磷脂酰絲氨酸(Phosphatidyl serine,PS)在細胞凋亡的早期，會從細胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。Annexin-V能與PS高親和力特異性結(jié)合，把綠色熒光分子FITC連接到Annexin-V即可標志內(nèi)膜翻轉(zhuǎn)的凋亡小體。而當細胞發(fā)生凋亡時，細胞膜通透性增強，PI可進入細胞結(jié)合DNA并發(fā)出熒光。因此通過流式分析Annexin-V-FITC和PI的信號分布便可區(qū)分凋亡早期（Annexin-V-FITC陽性+PI陰性）和晚期（Annexin-V-FITC陽性+PI陽性）的細胞（圖3）。

圖3

4、細胞毒性

在研究疾病的細胞模型中，你或許希望在過表達、敲降或敲除潛在藥物靶點的基礎上，高通量篩選藥物分子庫，從而鑒定出潛在的治療藥物，又或者是需要進行特定物質(zhì)細胞毒性的檢測，比如藥物篩選，那你可以通過細胞毒性檢測來篩選敏感化合物，或者篩選不同細胞系對某一化合物多個濃度的敏感性。實現(xiàn)細胞毒性檢測的方法有很多種，其中基于細胞代謝活性的CCK-8和ATP檢測法指示的是細胞活力（圖4），而基于代謝酶泄漏的LDH檢測法指示的則是細胞損傷程度（圖5），具體可以根據(jù)自身的研究需求來選擇。

圖4

圖5

5、細胞遷移、侵襲

在腫瘤治療中，普遍認為抑制腫瘤細胞遷移和侵襲是有效的治療手段。因此在對腫瘤細胞進行干預（過表達、敲降、敲除、點突變、藥物處理）后對細胞的遷移與侵襲能力進行檢測，可以作為評估干預效果的一個有效指標。

檢測細胞遷移能力和侵襲能力常用的實驗手段是Transwell實驗（圖6）。Transwell顧名思義是“穿孔實驗”，即將小室放在加入完全培養(yǎng)基的24孔板內(nèi)，小室中含有密密麻麻的小孔，將細胞懸液加到小室中，細胞可通過形變穿過小室中的孔而跑到營養(yǎng)更豐富的小室外部并貼在外側(cè)，最后通過對小室外部的細胞進行染色計數(shù)，就可以判斷細胞的遷移與侵襲能力的強弱。不過檢測遷移和侵襲的實驗方法還是存在差異，侵襲檢測需在聚碳酸酯膜上側(cè)鋪一層基質(zhì)膠，用以模仿細胞外基質(zhì)。