  當(dāng)你的才華還撐不起你的野心時，請潛下心來，腳踏實地，跟著我們慢慢進步。不知不覺在單細胞轉(zhuǎn)錄組領(lǐng)域做知識分析也快兩年了，通過文獻速遞這個欄目很幸運聚集了一些小伙伴攜手共進，一起成長。 文獻速遞欄目通過簡短介紹，擴充知識面，每天關(guān)注，希望你也能有所收獲！ 該文選取了早期恢復(fù)階段（ERS）和晚期恢復(fù)階段（LRS）來自10例COVID-19患者提供的70,858個細胞，以及5個健康供體（HC）的57,238個細胞繪制出COVID-19恢復(fù)階段血液中免疫細胞亞群的高分辨率轉(zhuǎn)錄組圖譜。并給出以下結(jié)論： 1、在COVID-19的早期恢復(fù)期（ERS），免疫反應(yīng)還將持續(xù)7天以上，說明COVID-19患者出院后仍有一定的復(fù)發(fā)風(fēng)險性； 2、單細胞分析顯示免疫細胞的相互作用，其特征是COVID-19患者的ERS將增加CD14+、IL-1β+的單核細胞群體； 3、預(yù)測IL-1β和M-CSF可能是炎性風(fēng)暴的新型候選靶基因； 4、新發(fā)現(xiàn)的病毒特異性BCR改變將有助于開發(fā)疫苗和抗體。 新冠肺炎現(xiàn)狀 COVID-19已在全世界很多地方傳播，目前已經(jīng)造成了近43萬人喪生。而近日我國國內(nèi)又開始出現(xiàn)本土新增病例，人心惶惶之際，都希望能盡快研發(fā)出針對COVID-19的有效抗病毒藥物和疫苗。COVID-19感染的癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱、干咳、疲勞、腹瀉、結(jié)膜炎和肺炎，部分患者出現(xiàn)重癥肺炎、急性呼吸窘迫綜合征或多器官功能衰竭。有研究表明，在COVID-19患者中已觀察到免疫系統(tǒng)失調(diào)的現(xiàn)象，然而，患者的關(guān)鍵免疫細胞亞群及其狀態(tài)的變化尚不清楚。 COVID-19患者的單細胞免疫圖譜 1 1. 實驗設(shè)計 樣本：
測序平臺：10x Genomic 分析方法：
1 2. 初步細胞圖譜結(jié)果 文章根據(jù)典型譜系標(biāo)志物和每個簇中特異上調(diào)的其他基因的主要將PBMC劃分為了三種免疫細胞，即Myeloid cells（36,442個細胞），NK and T cells（64,247）和B cells（10,177），劃分marker如表格所示。 恢復(fù)期COVID-19患者血液中的NK和T，B和骨髓細胞的概況 文章通過比較患者與健康組的情況,發(fā)現(xiàn)COVID-19患者的骨髓細胞比例更高，但NK和T細胞的比例更低。有趣的是，與ERS患者相比，LRS患者的B細胞、NK和T細胞更多，但骨髓細胞卻較少。結(jié)果表明，在COVID-19患者的外周血中，髓樣細胞增加，而NK和T細胞減少，并且ERS和LRS患者之間的免疫細胞組成有所不同。 細胞圖譜的第二次分型
1 恢復(fù)期COVID-19患者血液中的骨髓細胞亞群及其狀態(tài) 1. 將骨髓細胞劃分為6個亞群 2. HCs和COVID-19患者之間單核細胞亞群的差異顯著 在ERS患者中，經(jīng)典CD14 ++ 單核細胞（M1）的比例高于HCs，但在LRS患者中這一比例基本正常。這表明在病毒感染過程中，CD14 ++ 單核細胞的增加，促進了炎癥的發(fā)生。 1 恢復(fù)期COVID-19患者血液中的T細胞和NK細胞亞群及其狀態(tài) 1. 將T和NK細胞劃分為10個亞群 T細胞和NK細胞在呼吸道感染期間的病毒清除中起關(guān)鍵作用，聚類分析將T和NK淋巴細胞分為10個子集。
2. T細胞和NK細胞亞群的組成存在顯著差異
相比于HCs，COVID-19患者中CD4 + T細胞相關(guān)的抗炎基因下調(diào)，這表明CD4 + T細胞是病毒感染的主要參與者；COVID-19患者中CD8 + T細胞的比例降低，暗示了CD48+ T細胞的病毒清除作用 1 COVID-19患者的單細胞B細胞特征 1. 將B細胞劃分為4個亞群 通過diffusion maps預(yù)測B細胞的基因表達數(shù)據(jù)，文章鑒定了四個B細胞簇。
2. B細胞亞群的組成存在顯著差異
與HCs相比，COVID-19患者的漿細胞百分比顯著增加，而COVID-19患者的Naive B細胞百分比顯著降低。記憶B細胞和漿細胞（MPB）可能在控制病毒感染和過繼免疫的發(fā)展中起重要作用。ERS和HCs之間的基因差異表明COVID-19患者的B細胞反應(yīng)和抗體分泌增強。 單細胞BCR-seq分析表明，COVID-19患者的血清中IgA水平升高。并且ERS患者中（IgA + IgG + IgE）與（IgD + IgM）的比例顯著增加，并且隨著恢復(fù)時間呈下降趨勢。
在COVID-19患者中觀察到的BCR克隆擴增情況和VDJ基因表達偏好 使用sc-BCR-seq評估患者血液中克隆擴增的狀態(tài)，研究者發(fā)現(xiàn)與HCs相比，患者中始終保持較高的B細胞克隆性。并且在ERS中尤為顯著。這表明B細胞在SARS-CoV-2感染下經(jīng)歷獨特的VDJ克隆重排。在LRS患者中，隨著時間的推移，擴增的B細胞的差異基因顯著降低
接下來為了研究COVID-19患者中BCR的獨特變化和偏好基因，文章比較了COVID-19患者和HCs中VDJ基因的使用情況。發(fā)現(xiàn)與HCs相比，COVID-19患者中IGHV3家族的占比最高，尤其是IGHV3-7、IGHV3-15、IGHV3-21、IGHV3-23和IGHV3-30。
總之，COVID-19患者中B細胞的克隆性增加（主要由IgA和IgM同種型決定）以及IGHV基因的表達偏好提示了SARS-CoV-2引發(fā)疾病的作用。值得注意的是，COVID-19患者中IGV基因（尤其是IGHV3-23和IGHV3-7）的表達偏好為設(shè)計疫苗提供了框架。 COVID-19患者免疫細胞之間的Cell-to-cell communication 通過已經(jīng)發(fā)表細胞-細胞相互作用分析（10.1016 / j.celrep.2018.10.047(https://www.ncbi.nlm./pmc/articles/PMC7009724/)）預(yù)測細胞間的相互作用。細胞-細胞相互作用分析是基于免疫相關(guān)受體和配體的表達。通過計算一種細胞類型中配體的平均表達水平與另一種細胞類型中相應(yīng)的受體的平均表達水平的乘積，估算由特定配體-受體對兒介導(dǎo)的兩種細胞之間的潛在相互作用。 結(jié)果表明在COVID-19患者中，通過B細胞-單核細胞和B細胞-T細胞的相互作用，B細胞可以分泌大量IL-6、LTA和LTB，并與在單核細胞中表達的IL-6R、LTAR和LTBR結(jié)合，和大量的IL-6作用于T細胞以促進IFN-γ、IL-1β以及其它炎性細胞因子和趨化因子的分泌。因此，在ERS COVID-19患者的病發(fā)高峰時期，會出現(xiàn)高表達IL-6及其后代的炎性單核細胞，并有級聯(lián)反應(yīng)。
這些活化的免疫細胞可能大量進入肺和其他器官的循環(huán)，并發(fā)揮免疫破壞作用。在LRS COVID-19患者中，DC可能產(chǎn)生IL-18，TNFSF13和TNFSF13B來促進B細胞的增殖，然后在血液中分泌許多抗體。同時還會產(chǎn)生IL-7以促進T細胞的增殖。而T細胞則產(chǎn)生IL-2以促進B細胞的增殖和抗體產(chǎn)生。因此，細胞間的相互作用有助于我們理解為什么COVID-19患者表現(xiàn)出高單核細胞率和低淋巴細胞率，以及為什么康復(fù)患者外周血中淋巴細胞的比例逐漸增加。
總結(jié) 創(chuàng)新點 本研究提供了COVID-19康復(fù)患者的第一份單細胞免疫圖譜，文章分析了10位患者血液中的70,858個細胞的免疫種群的復(fù)雜性，并確定了ERS患者的高炎癥反應(yīng)，解釋了為什么有些患者出院后還會復(fù)發(fā)。 研究結(jié)果表明在COVID-19患者的恢復(fù)階段，T細胞和B細胞克隆高度增加，表明免疫系統(tǒng)已逐漸恢復(fù)；并鑒定出的新型BCR，以及IGHV3家族的表達偏好性。這在COVID-19免疫療法中具有潛在的臨床實用性。 缺點 基礎(chǔ)數(shù)據(jù)似乎不公開 只有康復(fù)患者正在進行疾病的機制 僅血液，無肺組織或肺液（BAL）等組織的數(shù)據(jù)，這對機制研究很重要 結(jié)果是描述性的，沒有進一步的驗證 尚不清楚結(jié)果與通常的感染后變化有何不同（例如，單核細胞與淋巴細胞之比升高是感染的一般標(biāo)志） 使用的計算方法不是最新技術(shù) 方法不夠詳細，無法重現(xiàn)分析 注釋不佳的數(shù)字很難得出結(jié)論 沒有提供統(tǒng)計檢驗，但發(fā)現(xiàn)聲稱“significant”
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