解決內(nèi)外源病毒污染，你必須了解的清除滅活病毒驗證及解決方案

劉得光3p6n6zqq 2021-07-20

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生物制品生產(chǎn)原輔材料通常為生物源的（如微生物、細(xì)胞、動物或人源的組織和體液等），具有潛在內(nèi)外源病毒污染的風(fēng)險。因此國內(nèi)外的相關(guān)法規(guī)要求生物制品在生產(chǎn)過程中應(yīng)包含至少一步或者多步具備滅活/清除病毒能力的工藝步驟，而且要對這些步驟的病毒滅活/清除能力進行驗證。理想情況下，病毒被添加到具有代表性的生產(chǎn)樣品中（該樣品與生產(chǎn)過程樣品有相同的濃度、緩沖體系和生產(chǎn)歷史等），以評估產(chǎn)品生產(chǎn)工藝清除\滅活已知和未知病毒的能力，法規(guī)要求至少達到4Lg的LRV值才是有效的清除滅活步驟。

污染來源及模式病毒

細(xì)胞系被認(rèn)為是病毒污染的關(guān)鍵來源，細(xì)胞庫（主細(xì)胞庫[MCB]和工作細(xì)胞庫[WCB]）在用于臨床生產(chǎn)之前需進行了廣泛而細(xì)致的檢測，以證明沒有病毒污染，ICH Q5A詳細(xì)介紹了細(xì)胞系鑒定檢測指南。

清除/滅活病毒驗證的目的是評估生產(chǎn)工藝清除/滅活已知病毒的能力，并通過表征其清除/滅活 “模型”病毒的能力來估計。病毒清除/滅活驗證選擇模型病毒的因素包括病毒滴度、病毒滴度檢測方法以及病毒可能對研究人員造成的健康危害。

通常用于病毒清除/滅活驗證的小鼠或倉鼠細(xì)胞系小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒模型是異嗜性小鼠白血病病毒（X-MuLV）和鼠細(xì)小病毒（MMV），MMV是一種小型的非包膜病毒，由于低pH條件不能使其失活，因此通常更難清除。

在新藥IND申請階段，需要對至少兩種模型病毒進行病毒清除/滅活驗證研究，通常選擇一種模式逆轉(zhuǎn)錄病毒（X-MuLV）和一種細(xì)小病毒（MMV）。在BLA申請階段，通常使用至少3-5種模型病毒進行病毒清除/滅活研究。下表為一組在新藥Phase III階段鼠細(xì)胞系衍生產(chǎn)品病毒清除/滅活研究中模型病毒。

清除/滅活病毒工藝

過濾

生物制品生產(chǎn)過程中，過濾是一個關(guān)鍵的除病毒步驟，雖然過濾已被證明對較大的病毒顆粒有可靠的去除效果，但去除尺寸很小的病毒（如細(xì)小病毒）的效果較差。Miesegaes等人總結(jié)了除病毒過濾的數(shù)據(jù)、工藝操作范圍和減壓對除病毒過濾的影響。在除病毒過濾加標(biāo)研究中，病毒原液的質(zhì)量對病毒去除過濾器的性能有重大影響。高純度的病毒儲備溶液可確保病毒過濾器不會因來自加標(biāo)病毒的微粒而堵塞，并導(dǎo)致過濾膜蛋白質(zhì)載量顯著提升。

眾所周知，低pH條件可以成功地滅活包膜病毒，這與單克隆抗體（mAb）下游純化工藝非常兼容，Protein A捕獲柱通常在低pH下洗脫，洗脫之后是低pH孵育步驟，以滅活病毒。

病毒滅活步驟通常在pH3.0和4.0之間進行，已經(jīng)證明，穩(wěn)定的病毒滅活需要3.8或更低的pH值。在pH值為3.8或以下時，病毒滅活非常迅速，通常在10-15分鐘內(nèi)完成。對于低pH值滅活需建立滅活動力學(xué)曲線。

有機溶劑/表面活性劑

對于一些不能耐受低pH的產(chǎn)品，通常使用有機溶劑/表面活性劑（S/D）作為滅活包膜逆轉(zhuǎn)錄病毒的方法。S/D是處理血液制品的主要方法之一，也常用于滅活重組蛋白產(chǎn)品中的包膜病毒，特別是當(dāng)產(chǎn)品不能耐受低pH。常用的滅活條件是0.3% TNBP和1%吐溫-80，24℃處理至少6h；0.3%TNBP和1%Triton X-100，24℃處理至少4小時。S/D處理前應(yīng)先用1um濾器除去蛋白溶液中可能存在的顆粒（顆?？赡懿啬洳《緩亩绊懖《緶缁钚Ч?。加入S/D后應(yīng)確保是均一的混合物。在滅活病毒全過程中應(yīng)將溫度控制在規(guī)定的范圍內(nèi)。

色譜層析

常用的除病毒色譜層析方法有親和層析（如Protein A）和離子交換層析。

Protein A親和層析為單克隆抗體和Fc融合蛋白提供了高度的選擇性，并被廣泛用于它們的純化。Protein A親和層析通?？梢赃_到4-5個LRV的逆轉(zhuǎn)錄病毒清除率；

陰離子交換色譜法是一種強大的逆轉(zhuǎn)錄病毒清除方法。在適當(dāng)?shù)臈l件下，該步驟還可以提供>4 LRV。因此，這是一個首選的病毒清除步驟，特別是對于單抗這種典型的堿性蛋白質(zhì)，可以通過陰離子層析純化及去除病毒。陽離子交換和疏水層析已被證明具有相對較低的LRV。根據(jù)工藝條件，通常可獲得1-3個對數(shù)的LRV。

其他

A．巴氏消毒法：對于有一定熱穩(wěn)定性的產(chǎn)品，可采用巴氏消毒法，巴氏消毒法可快殺滅速偽狂犬病病毒(PRV)，Sindbis病毒和HIV-1等病毒；經(jīng)實踐證明白蛋白的巴氏消毒法對HIV和肝炎病毒是安全的，其病毒滅活條件已經(jīng)很完善。

B．干熱法：80℃加熱72h，可以滅活HBV、HCV、HIV及AV等病毒，但應(yīng)考慮制品的水分含量、制劑組成（如糖、蛋白、鹽分等）對病毒滅活效果的影響。病毒滅活用的干熱箱至少每半年驗證一次。

清除/滅活毒方案設(shè)計

?除/滅病毒驗證研究應(yīng)符合GLP的要求；

?研究影響去除/滅活病毒效果的參數(shù)允許變化的幅度；

?研究病毒滅活動力學(xué)，包括病毒滅活速率和滅活曲線；

?指示病毒滴度應(yīng)盡可能高（病毒滴度應(yīng)≥10^6/ml）;

如可能，驗證過程中每步取出的樣品應(yīng)盡快直接檢測病毒滴度，不做進一步處理（如超離心、透析或保存等），如樣品必須做進一步處理，或不同時間取出的樣品要在同一時間內(nèi)進行測定，應(yīng)考慮這些處理對病毒滴度檢測結(jié)果的影響。

病毒滴度檢測方法

常用的病毒滴度檢測方法包括蝕斑法、TCID₅₀及Q-PCR法等方法。

蝕斑法和TCID₅₀法適用于感染并產(chǎn)生致病變效應(yīng)的病毒的滴度測定，多數(shù)病毒感染體外培養(yǎng)的細(xì)胞后，常引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，如細(xì)胞團縮、裂解和細(xì)胞腫大等，這種改變稱為病毒致病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)，可以直接通過顯微鏡觀察，亦可通過染色識別和判斷。

熒光定量PCR（qPCR）可以將DNA序列的一段特定區(qū)域進行數(shù)量級擴增，因此是一種極其靈敏的檢測方法，廣泛應(yīng)用于病毒的定性定量分析。該方法具有快速、特異、靈敏等、穩(wěn)定性好（≤15%）優(yōu)點。

解決方案

浙江恒馭生物科技有限公司（簡稱：恒馭生物）是一家由頂尖科研團隊創(chuàng)立，致力于為全球創(chuàng)新藥企提供生物檢測及相關(guān)工藝驗證、開發(fā)服務(wù)及產(chǎn)品的綜合供應(yīng)商。

恒馭生物依托國內(nèi)多地的BSL-2級實驗平臺、符合ISO9001、CNAS及GLP要求下的質(zhì)量體系，為客戶藥物開發(fā)及上市生產(chǎn)階段提供有保障的生物安全性檢測服務(wù)，現(xiàn)階段已覆蓋病毒清除滅活工藝研究、細(xì)胞株/庫檢定、原材料檢測服務(wù)。

在病毒清除/滅活試驗平臺方面，恒馭生物擁有P2認(rèn)證實驗室平臺、HyPure系列高滴度高純度病毒；在清除/滅活病毒驗證方法方面，恒馭生物可根據(jù)客戶需要對全部法規(guī)接受的主要方法進行去病毒工藝驗證，覆蓋生物制品（血液制品、真核細(xì)胞表達產(chǎn)品，如抗體、重組蛋白）、生化藥品（動物來源）及II、III類醫(yī)療器械產(chǎn)品。

在模式病毒方面，藥典示例常用指示病毒全覆蓋，并具備完善的細(xì)胞庫檢測服務(wù)（包括支原體、內(nèi)外源病毒因子、致瘤性、成瘤性及染色體檢測），在病毒滴度檢測方法方面，建立了齊全的（如TCID₅₀、qPCR等）病毒滴度定量檢測方法。

國產(chǎn)新藥研發(fā)晝夜兼程，對于藥品“質(zhì)量及安全”的研究與關(guān)注，是永恒的使命。基于此，由恒馭生物聯(lián)合佰傲谷BioValley舉辦的“GO H-Quality生物制藥安全及質(zhì)量守護者”高端閉門系列沙龍活動之蘇州站將于2021年7月31日在蘇州金雞湖凱賓斯基大酒店舉辦。本次活動特邀多位行業(yè)大咖齊聚一堂，通過輕松開放的氛圍，致力于打造一個深刻精致、深度交流的平臺，共同助力推動中國生物醫(yī)藥質(zhì)量安全的發(fā)展。誠邀您蒞臨本次盛會！

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（閉門審核制，僅限30位）

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小編聯(lián)系方式：18017839520（微信同號）

活動流程安排

12:30-13:00 嘉賓簽到

13:00-13:05 開場介紹

13:05-13:40

主題：實現(xiàn)高效病毒清除的下游工藝開發(fā)控制策略

嘉賓：汪才坤 康日百奧下游研發(fā)負(fù)責(zé)人

13:40-14:20

主題：生物蛋白藥的表征

嘉賓：史力怡道生物董事長

14:20-14:50 茶歇

14:50-15:30

主題：生物制品生產(chǎn)中病毒清除驗證策略

嘉賓：朱向瑩 恒馭生物 CEO

15:30-16:10

主題：臨床研究質(zhì)量管理體系簡介

嘉賓：蔣燕敏 和鉑醫(yī)藥質(zhì)量部負(fù)責(zé)人

16:10-17:00 圓桌討論

﹡中國規(guī)模和創(chuàng)新速度對全球生物制藥價值鏈的影響

﹡國外內(nèi)生物藥在 R&D、藥品質(zhì)量和人才培養(yǎng)的差距和展望

﹡回首制藥生涯，走過的“坎”和“幸”

主持人：朱向瑩 恒馭生物 CEO

討論嘉賓：

史力 怡道生物董事長

秦剛 啟德醫(yī)藥董事長（TBD）

蔣燕敏 和鉑醫(yī)藥質(zhì)量部負(fù)責(zé)人

郭樹華 普樂康醫(yī)藥董事長

17:00-17:30

全體與會嘉賓合影

17:30

當(dāng)日活動結(jié)束~

參考文獻

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