【原】StringTie 插件 | 直接在 Windows 下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組組裝與讀段計數(shù)

生信藥丸 2021-07-26

展開全文

注：同時支持 Windows 和 MacOS。

寫在前面

前述，我已經(jīng)寫了兩個 TBtools 插件，實(shí)現(xiàn)了在純粹的WIndows環(huán)境下（非虛擬機(jī)，非WSL），使用 Hisat2 進(jìn)行基因組索引構(gòu)建以及轉(zhuǎn)錄本回帖。最近家里事情較多，期間不少時間可以天馬行空的想事情。過于具體的生物學(xué)問題難以思考出個答案，畢竟是以實(shí)踐為主。但數(shù)據(jù)分析上的鬼點(diǎn)子倒是非常合適。
過去幾年，正是這類時間，讓我能設(shè)計出 TBtools/JIGplot，優(yōu)化出其中各式各樣的特性。正如現(xiàn)在 TBtools 的插件模式，也是臨時想到的實(shí)現(xiàn)方式。
今天躺著，突然想著：

目的是矯正基因注釋
手段是在我改造的基因?yàn)g覽器 IGV-GSAme 矯正
輸入是基因組，待矯正的基因結(jié)構(gòu)注釋以及RNA讀段回帖的BAM
操作是基于RNA的Alignments，手動調(diào)整注釋

那么問題來了，要在windows完成全部工作，我們會遇到幾個問題

IGV的特性不足，通過 IGV-GSAme 已經(jīng)解決
轉(zhuǎn)錄組回帖，通過 TBtools 的 Hisat2 插件也解決了
基因組局部區(qū)域的有參考組裝，無解!

既然無解，那我完全可以鼓搗一個windows下的stringTie，中間做個接口，那么就可以實(shí)現(xiàn)局部組裝（注意，指定一個區(qū)域組裝，常常反而能組裝出準(zhǔn)確的結(jié)果，具體自行思考）。千里之行始于足下，在讓 IGV-GSAme 變得更強(qiáng)之前，先做一個簡單的東西，TBtools插件。

StringTie Wrapper - 新的 TBtools 插件

一共兩個對應(yīng)的是 Stringtie 兩個主要功能：

Stringtie Assembly : 轉(zhuǎn)錄組組裝
Stringtie Quantify : 轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量估計

StringTie Assembly 插件的使用

對于組裝一步，參數(shù)簡單，用戶只需要提供排序好的BAM文件即可，這些文件，事實(shí)上可以通過前幾天推的 Hisat-build 和 Hisat-align 插件來獲取。需要注意的有三點(diǎn)：

參考物種基因結(jié)構(gòu)注釋是可選的
設(shè)置輸出目錄而不是輸出文件，因?yàn)榻M裝時是單個bam文件單獨(dú)組裝，最后再進(jìn)行一次merge，得到最終可用的 GTF 文件（具體Fasta序列提取，可直接使用 TBtools 的 GXF Sequence Extract，請參考公號前述推文）
并行線程數(shù)，應(yīng)該注意，此處的并行線程數(shù)與Stringtie軟件的線程數(shù)并不等價。（我調(diào)整了stringtie源碼，編譯并使其可以在windows下運(yùn)行，但windows系統(tǒng)限制，所以只能單線程，且速度上不來。這沒關(guān)系，我們可以多個文件同時組裝，這樣也就只需要使用stringtie的單線程模式，畢竟很多時候，我們并不可能做一個樣品的轉(zhuǎn)錄組測序和組裝 - PS：windows下可能會慢不少，比如6G的轉(zhuǎn)錄組，估計組裝時間大概要到 1個小時，在我的筆記本上。不過同時跑2個，那么也是1個小時嘛..）
組裝結(jié)果大體如下，我做了兩個實(shí)際數(shù)據(jù)的，

StringTie Quantify 插件的使用

使用簡單，用戶需要的注意的幾乎只有三點(diǎn)：

排序好的BAM文件
一個必須的基因結(jié)構(gòu)注釋文件，可以是gff3也可以是gtf，比如使用 StringTie Assembly插件整理的組裝結(jié)果。
ReadLength, 這一參數(shù)即測序讀長。因?yàn)镾tringTie計算的其實(shí)是Coverage，并沒有讀段計數(shù)這一步。常見的操作是簡單地基于Coverage反推raw counts。于是read length成為必要。

整體上會輸出六個矩陣，具體大伙自己看名字就知道是啥。

即，轉(zhuǎn)錄本水平或基因水平的Counts，F(xiàn)PKM，TPM矩陣?？刹榭雌渲心硞€。

注意到，我前面做StringTie Assembly的時候設(shè)置了參考注釋，所以AcoXXXX等ID為原始注釋ID（事實(shí)上是沒有被組裝出來的，一般是覆蓋率極低），而MSTRGXXXX等為已有注釋中被當(dāng)前樣品覆蓋以及新注釋出來的基因。
PS：四個插件將會一并上線至插件商店，暫時票價應(yīng)該會定位 100，打包估計 365，具體再定。

感興趣的，想上車的，請參考前述《Plugin | 高速版插件商店！我又有一個絕妙的 idea》推文。