干細胞的制備與鑒定

小夢想在努力 2021-08-09

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干細胞的體外培養(yǎng)特性

與一些成熟細胞相比，干細胞的體外培養(yǎng)條件要求相對苛刻，因為它在體外培養(yǎng)條件下容易自然分化而失去干細胞的基本特性。干細胞的體外培養(yǎng)難點是既要維持干細胞的“干性”，又要令其增殖而保持未分化狀態(tài)，這本身就是一對矛盾。由于不同來源的干細胞，其生長特性差異較大，體外培養(yǎng)條件也有一定差別，一般需要根據(jù)不同類型的干細胞建立相應的個性化培養(yǎng)體系，特別是將某種干細胞建成細胞系，更需要建立穩(wěn)定的培養(yǎng)技術。體外制備干細胞包括干細胞或富含干細胞的材料采集、分離純化、擴增、鑒定及儲存等過程，分離、培養(yǎng)過程需要在無菌層流實驗室中進行，需要在培養(yǎng)體系中添加一些維持其“干性”和促進增殖的因子。

胚胎干細胞的體外分離培養(yǎng)原始材料來源包括受精卵發(fā)育而來的桑葚胚、囊胚內(nèi)細胞團、胎兒生殖脊等。

體外制備包括以下過程：

①原始胚胎干細胞的獲?。?/span>采用機械法分離、胰酶或膠原酶消化獲得原始胚胎干細胞懸液。

②細胞傳代培養(yǎng)：將細胞懸液接種在改良的Eargle培養(yǎng)液中培養(yǎng)2~3天，然后轉(zhuǎn)移到經(jīng)放射線照射或絲裂霉素處理的成纖維細胞飼養(yǎng)層上進行傳代培養(yǎng)。由于處理后的成纖維細胞失去了增殖能力，但還能分泌多種細胞因子，可維持胚胎干細胞的“干性”和促進其增殖。飼養(yǎng)層細胞一般采用3T3、STO等小鼠細胞系，也可采用自制的胎鼠成纖維細胞。培養(yǎng)體系中，一般還需要添加適當濃度的胎牛血清（FBS）、非必需氨基酸、β-巰基乙醇、白血病抑制因子（LIF）、干細胞因子（SCF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）等，其中LIF具有抑制胚胎干細胞分化的功能。為防止細菌污染，可按其他細胞培養(yǎng)體系的要求加入雙抗。胚胎干細胞在培養(yǎng)體系中呈克隆生長，待單個細胞長成集落后，挑取細胞集落，用低濃度的胰酶消化分散后，繼續(xù)用上述培養(yǎng)體系進行傳代培養(yǎng)。經(jīng)反復傳代培養(yǎng)，可獲得高純度的生長旺盛的胚胎干細胞。如果撤除培養(yǎng)體系中的血清成分，胚胎干細胞會自動分化形成擬胚胎體，其中含有多種類型的組織細胞，說明血清中可能含有維持胚胎干細胞特性的因子。

③細胞鑒定：對細胞的生長特性、表型標志、核型、細胞周期、分化潛能進行分析鑒定。

④胚胎細胞儲存：將胚胎干細胞置于含有10%二甲基亞砜（MDOS）的胚胎干細胞培養(yǎng)液中，按常規(guī)方法程序降溫，最后置于-196℃液氮中長期保存。最近些年還開發(fā)出一些無血清的干細胞培養(yǎng)基，實驗證實干細胞在這些培養(yǎng)基中生長良好，避免了添加血清中攜帶病原的可能性，減少了胚胎干細胞在體內(nèi)研究與應用中的干擾因素，為臨床應用奠定了基礎。基因?qū)牖蛐》肿踊衔锏日T導培養(yǎng)獲得的胚胎干細胞樣細胞，其培養(yǎng)、擴增條件與胚胎干細胞相似。優(yōu)化胚胎干細胞的培養(yǎng)條件，研究更為高效的培養(yǎng)基，特別是不含血清的培養(yǎng)基仍然是胚胎干細胞研究的重要方面。

成體干細胞的種類繁多，幾乎在所有組織中均發(fā)現(xiàn)有干細胞存在，不同組織來源的干細胞在數(shù)量、細胞形態(tài)、生長特性、表型標志、分化條件及分化潛能上千差萬別，體外培養(yǎng)條件要求不盡一致，很難建立一套適用于所有成體干細胞培養(yǎng)的通用技術方案，需要針對不同類型的成體干細胞建立“個性化”體外制備技術。由于成體干細胞可以來源于自體，避免了免疫排斥和胚胎干細胞涉及的倫理及安全問題，在臨床上具有優(yōu)先應用優(yōu)勢，因此在2000年以來受到高度重視，在體外制備技術方面取得了諸多突破性成果，極大地促進了成體干細胞技術產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和轉(zhuǎn)化應用。

成體干細胞體外制備通常也包括材料采集、分離純化、體外擴增、誘導分化、儲存、復蘇等關鍵技術環(huán)節(jié)。在采集獲得成體組織之后，根據(jù)組織來源及特性，分別采用機械分離、密度梯度離心、酶消化、免疫磁珠分離、流式細胞術分離等方法分離制備成單細胞懸液，然后將其置于特定的培養(yǎng)體系中進行原代和傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)體系中一般也要加入維持“干性”和促進其生長的細胞因子，例如干細胞因子（SCF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）等。為進一步純化干細胞，在培養(yǎng)過程中根據(jù)干細胞的特性進行貼壁培養(yǎng)、差速貼壁、克隆篩選、免疫吸附等辦法進一步純化和去除雜細胞，例如利用間充質(zhì)干細胞貼壁生長的特性進行貼壁培養(yǎng)可獲得骨髓、脂肪、臍帶等組織中的間充質(zhì)干細胞，采用差速貼壁法可去除其中的少量成纖維細胞。

有一些成體干細胞可采用組織塊培養(yǎng)法獲得，方法是將組織剪碎成小于1mm3大小的組織塊，將其接種于培養(yǎng)瓶底，先加入少量培養(yǎng)液，待組織塊貼壁后再補充培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，其中的干細胞可沿組織塊周圍長出，然后去除組織塊并進行傳代擴增獲得大量干細胞。這種方法適用于臍帶間充質(zhì)干細胞等貼壁生長較快的干細胞，同一組織塊可進行反復培養(yǎng)。骨髓、臍血組織中的造血干細胞一般采用流式細胞術、免疫磁珠法可分離獲得純度大于99%的造血干細胞，但體外擴增相對困難，一般要在半固體培養(yǎng)基上進行擴增，培養(yǎng)基中需要添加血清、多種促進其生長的因子。也有人認為，在干細胞培養(yǎng)體系中添加血小板生長因子可促進干細胞生長，甚至可以取代血清添加。還有一些干細胞在體外培養(yǎng)體系中適于懸浮生長并形成懸浮細胞球，例如海馬神經(jīng)干細胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)干細胞等?？傊?，成體干細胞的分離主要利用其生長特性進行選擇性培養(yǎng)或依據(jù)相對特異的標志性細胞表面抗原進行免疫學篩選，體外擴增則需要根據(jù)其生長特性建立不同的培養(yǎng)體系和技術方法，培養(yǎng)體系中需要添加促進生長和維持“干性”的細胞因子，否則傳代培養(yǎng)后，干細胞會自動分化和老化而失去活性。

干細胞的鑒定

主要依據(jù)其在形態(tài)特征、細胞成分與結構、基因修飾與表達差異、生長特性、表型標志、體內(nèi)外分化潛能等方面與成熟細胞的差異，分別采用光學顯微鏡觀察、電鏡觀察、免疫組織化學、組織病理觀察、流式細胞術、基因結構與開放表達、表觀遺傳分析等技術，從不同側面建立干細胞的鑒定技術方法、指標體系和標準。從概念上講，干細胞的最基本特征是自我更新能力和多向分化潛能，增殖能力是考察干細胞活性的重要依據(jù)，而在體內(nèi)外是否能夠向多種類型的成熟細胞分化則是認定干細胞的“金標準”。因此，胚胎干細胞重點分析其全能性，而成體干細胞則重點分析其是否能夠向2種以上不同組織類型的成熟細胞分化，特別是是否能夠分化為不同胚層的功能細胞。

體外長期培養(yǎng)的胚胎干細胞鑒定：

①形態(tài)、結構特點：呈圓形或梭形，也有一些呈多角形，體積小，細胞核大，胞質(zhì)少，可見一個或多個細胞核，細胞結構相對簡單，細胞質(zhì)內(nèi)除有大量游離的核糖體和線粒體外，其他細胞器很少。

②生長特性：小鼠的胚胎干細胞呈巢式或集落式生長，邊緣光滑，細胞排列緊密。人胚胎干細胞的克隆生長特點與恒河猴等靈長類動物的胚胎干細胞相似，細胞形態(tài)呈扁平，細胞之間呈緊密連接，易被胰酶消化，但靈長類動物的胚胎干細胞呈松散連接。

③表型標志：胚胎干細胞表達胚胎階段特異性抗原（SSEA）和癌胚胎抗原（CEA），但表達模式具有種屬特異性。人和靈長類動物ES細胞表達SSEA-3、SSEA-4，不表達SSEA-1，人生殖脊干細胞（EG）則表達SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4，小鼠以表達SSEA-1為主。胚胎干細胞高表達堿性磷酸酶，堿性磷酸酶染色呈強陽性。還表達干細胞因子（stem cell factor）、生殖細胞核因子（germ cell nuclear factor）、轉(zhuǎn)錄因子 Oct3/4、端粒酶、高分子糖蛋白TRA-1-60和TRA-1-81、CD30、GCTM2、GenesisDG等。利用這些差異和表面標志物，可以驗證胚胎干細胞。

④體外分化能力：主要包括擬胚胎體的形成和定向分化潛能分析。從胚胎干細胞培養(yǎng)體系中去除飼養(yǎng)層和分化抑制因子后繼續(xù)培養(yǎng)，可自動形成擬胚胎體，其中包含有內(nèi)外胚層的三微結構團塊。繼續(xù)培養(yǎng)還可以形成含有體腔的囊裝擬胚胎體，其中含有內(nèi)、中、外3個胚層的血管、神經(jīng)、肌肉、腺體、骨等微型組織和多種譜系的細胞。在撤除飼養(yǎng)層和分化抑制因子之后，向培養(yǎng)體系中添加特定的誘導因子，包括小分子化合物、生物活性因子或物理因素，均可誘導ES細特定類型的成熟細胞分化并表達相應的特異性抗原標志，具有相應的細胞功能。

⑤體內(nèi)分化潛能：將ES細胞移植到免疫缺陷小鼠，如SCID鼠、裸鼠皮下后，可逐漸長成畸胎瘤，組織學觀察可見內(nèi)、中、外3個胚層的組織和細胞，對組織切片進行免疫組織化學染色，可見多種類型的成熟細胞。將胚胎干細胞通過顯微注射技術注射到其他正在發(fā)育生長的囊胚內(nèi)細胞團中，可以培育出嵌合體動物，胚胎干細胞可隨胚胎發(fā)育進入各種組織并向相應類型的功能細胞分化，整合于組織之中并發(fā)揮功能，而且也可以分化為生殖細胞，具有生殖系傳遞功能。如果將胚胎干細胞定位移植到成體的特定組織中，它可以在組織微環(huán)境的誘導下“入鄉(xiāng)隨俗”，定向分化為所在組織類型的功能細胞，例如將胚胎干細胞移植到帕金森動物模型的紋狀體中可分化為能夠產(chǎn)生多巴胺和5-羥色胺的神經(jīng)元樣細胞，使帕金森癥狀改善。

成體干細胞的鑒定相對困難，因為缺乏特異性的抗原標志物，生長特性和形態(tài)各異，分化潛能不如胚胎干細胞大。盡管在許多組織中存在干細胞，但由于其數(shù)量很少，且與組織中的其他細胞無明顯的差別，無法清楚地區(qū)分它們。因此，在各種不同的組織中如何科學地區(qū)分這些種類稀少的干細胞，或者如何發(fā)現(xiàn)一有效簡便的鑒別方法，是干細胞研究人員所必須解決的問題。過去人們普遍采用的鑒別干細胞的最基本且可靠的實驗手段是利用干細胞最顯著的兩個特征，即慢周期性和自我更新能力，來鑒定在體與離體干細胞。由于干細胞的慢周期性，可采用標記滯留細胞的分析方法識別在體的靜息干細胞。干細胞的自我更新能力在體外培養(yǎng)則表現(xiàn)為無限的增殖能力，形成細胞克隆，從而識別離體的干細胞。但這兩種方法應用時具有一定的限制性。

主要鑒定方法：

①表型抗原標志分析：目前研究人員普遍采用的方法是依靠干細胞的表面標志來區(qū)分和鑒定各種干細胞，通過干細胞表面受體可以區(qū)分干細胞和其他細胞。成體組織來源的離體干細胞鑒定主要通過一系列陽性和陰性標志的分析，綜合判定是否符合干細胞的表型。例如間充質(zhì)干細胞表達CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD124、SH2、SH3等，而不表達造血干細CD106、CD124、SH2、SH3等，而不表達造血干細胞的抗原標志物 CD34、CD14、CD45等。利用干細胞表面受體來鑒別干細胞有兩種方法，利用熒光素的化學特性和受體的獨特的結構相結合的方法來鑒別干細胞群。

②體外定向誘導分化：一些生物活性因子、化學物質(zhì)或組合因子可誘導成體干細胞定向分化，一些組織提取物也具有誘導成體干細胞定向分化的傾向，導入特定基因并令其高表達可穩(wěn)定誘導成體干細胞分化為某種類型的功能細胞。要驗證成體干細胞是否具有多向分化潛能，至少應考慮分化為3種以上不同組織類型的成熟細胞，選擇定向誘導分化為不同胚層細胞分化方向，例如臍帶、骨髓、脂肪來源的間充質(zhì)干細胞鑒定常定向誘導分化為神經(jīng)、脂肪、骨、軟骨、肌肉等。

③體內(nèi)誘導分化：成體干細胞接種于免疫缺陷動物皮下一般難以形成包含多種組織類型細胞的組織，一般是定向注射于特定的組織中，觀察其是否可在組織微環(huán)境誘導下定向分化，例如注射入神經(jīng)、肌肉、肝、骨髓等組織中，通過體內(nèi)示蹤、免疫組織化學、表型變化、功能分析等方法驗證其在體內(nèi)特定微環(huán)境中的分布和分化方向。對于單細胞生物和低等動物，可以很精確地通過其形態(tài)和定位而鑒別出其中的干細胞。例如在果蠅生殖腺和外周神經(jīng)系統(tǒng)（PNS）中，干細胞和非干細胞的子代細胞對于其周圍細胞已具有很明確限定的方向。而在人和哺乳動物的許多組織中，干細胞的位置、微環(huán)境結構尚不完全清楚，有些干細胞表面的分子標志未完全得到確定，尋找成體干細胞的特異性標志并為干細胞分離、鑒別提供新線索仍然是干細胞研究的重要方向。

隨著基因結構、表觀遺傳和基因表達等分子生物學技術的發(fā)展，特別是大規(guī)?；驕y序技術、表觀遺傳修飾分析及基因表達芯片技術的廣泛應用，再加上大數(shù)據(jù)分析技術的不斷普及，干細胞鑒定越來越精準、細致、全面。如利用生物芯片分析結合高通量基因測序技術分析干細胞相關基因的開放表達及表達譜分析干細胞的表型、功能，鑒別干細胞中特異性的基因和轉(zhuǎn)錄因子等。用PCR技術來鑒別具有活化的和導致細胞具有特性的基因的表達。這些技術有助于研究人員通過識別“基因標志”來區(qū)分干細胞。例如：PDX-1基因是一種轉(zhuǎn)錄因子蛋白，負責胰島素基因的最初活化，研究人員通過識別它來鑒別出能發(fā)育成胰島細胞的干細胞。還可利用基因工程技術結合熒光素技術而不依賴干細胞的表面標志來鑒別干細胞，這種技術的重要性就在于允許人們檢測分化或定向分化時的干細胞。利用這種方法，可以進行早期的干細胞分離，在組織中識別出它們或在分化的過程中追蹤它們。這些鑒別手段目前在許多實驗室已被廣泛應用，而且在未來的干細胞研究中將起主要作用，相信隨著對干細胞的研究日益深入，將會探索到更為準確、省時的方法。