什么是DNA甲基化？

簡單來說，DNA甲基化就是在DNA甲基化轉移酶(DNMT)的作用下將甲基選擇性地添加到胞嘧啶上形成5′-甲基胞嘧啶的過程。DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一，在維持正常細胞功能、遺傳印記、胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，是目前及未來很長一段時間的研究熱點之一。

DNA甲基化測序

隨著高通量測序技術的發(fā)展，我們能夠從全基因組水平來分析5’-甲基胞嘧啶及組蛋白修飾等事件，發(fā)現(xiàn)很多基因組學研究發(fā)現(xiàn)不了的東西，這就是 “DNA甲基化測序”！且近年來測序成本的不斷下降及測序技術的迭代更新，DNA甲基化測序方法可選擇性更多了。

目前表觀遺傳學DNA甲基化研究測序方法常見的有：全基因組重亞硫酸鹽甲基化測序[WGBS]、精準DNA甲基化和羥甲基化測序[oxBS-seq]、優(yōu)化版簡化甲基化測序[RRBS/dRRBS/XRBS]、單/微量細胞全基因組甲基化測序[scWGBS]、擴增子（羥）甲基化測序、（羥）甲基化DNA免疫共沉淀測序[(h)MeDIP-seq]等6種，適用于不同DNA甲基化研究方向的解決方案。

（1）全基因組重亞硫酸鹽甲基化測序（WGBS）

全基因組重亞硫酸鹽甲基化測序（WGBS）可以在全基因組范圍內精確的檢測所有單個胞嘧啶堿基（C堿基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金標準。WGBS能為基因組DNA甲基化時空特異性修飾的研究提供重要技術支持，能廣泛應用在個體發(fā)育、衰老和疾病等生命過程的機制研究中，也是各物種甲基化圖譜研究的首選方法。

常規(guī)全基因組甲基化測序技術通過T4-DNA連接酶，在超聲波打斷基因組DNA片段的兩端連接接頭序列，連接產(chǎn)物通過重亞硫酸鹽處理將未甲基化修飾的胞嘧啶C轉變?yōu)槟蜞奏，進而通過接頭序列介導的 PCR 技術將尿嘧啶U轉變?yōu)樾叵汆奏。

    技術優(yōu)勢：

l 應用范圍廣：適用于人和大多數(shù)動植物研究（參考基因組已知）

l 全基因組覆蓋：最大限度地獲取完整的全基因組甲基化信息，精確繪制甲基化圖譜

l 單堿基分辨率：可精確分析每一個C堿基的甲基化狀態(tài)

研究案例：

Whole-Genome Bisulfite Sequencing of Two Distinct Interconvertible DNA Methylomes of Mouse Embryonic Stem Cells. 兩種狀態(tài)的小鼠胚胎干細胞的甲基化組學研究

①    背景

小鼠胚胎干細胞一般生長在含有血清的基質中，被稱作血清干細胞(serum ESCs)；加兩種激酶抑制因子使胚胎干細胞在無血清的情況下更能保持多能性的基態(tài)，這種干細胞稱為2i干細胞(2i ESCs)；這兩種狀態(tài)的胚胎干細胞可以互相轉化。以前這方面的甲基化研究大多基于質譜，覆蓋度和研究結果有限，尚缺乏2i胚胎干細胞的甲基化組學研究。

②    方法

利用全基因組重亞硫酸鹽甲基化測序（WGBS），對這兩種可互相轉換的小鼠胚胎干細胞進行甲基化組學研究

③    結論

全面準確的檢測了兩種小鼠胚胎干細胞的DNA甲基化修飾并進行了系統(tǒng)的比較；同serum ESCs相比，雄性2iESCs全局低甲基化；在血清中，雌性ESCs跟雄性2i ESCs類似呈現(xiàn)全局低甲基化，而在2i ESCs狀態(tài)下，甲基化水平會進一步降低。

不同狀態(tài)下小鼠胚胎干細胞的甲基化修飾比較

（2）精準DNA甲基化和羥甲基化測序（oxBS-seq）

DNA羥甲基化是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的DNA修飾并迅速成為研究熱點。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)之前被認為是檢測DNA甲基化“金標準”的重亞硫酸鹽測序并不能區(qū)分DNA甲基化（5mC）和DNA羥甲基化（5hmC）。易基因聯(lián)合劍橋大學建立了化學氧化法結合重亞硫酸鹽轉化的測序技術（oxidative bisulfite sequencing, oxBS-Seq），該技術不僅可以精確檢測DNA甲基化，排除DNA羥甲基化的影響，還可以雙文庫結合同時單堿基分辨率精確檢測DNA羥甲基化。

技術原理：

oxBS-Seq將5hmC氧化5fC，后者可以被Bisulfite轉為U，從而實現(xiàn)5mC的精準檢測；同時，經(jīng)過與常規(guī)Bisulfite結果比較可以實現(xiàn)對5hmC的準確檢測。

技術優(yōu)勢：

l DNA甲基化檢測全新的“金標準”

l 全基因組單堿基檢測DNA羥甲基化修飾

l 多重標準驗證高氧化效率和高Bisulfite轉換率

l 實驗偏好性低，重復性高（R2>0.98）

l 可滿足多種測序應用需求：簡化基因組氧化甲基化測序（oxRRBS），目標區(qū)域氧化甲基化測序（Target-oxBS）

研究案例：

Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution（oxBS 技術單堿基檢測5mC和5hmC在鼠胚胎干細胞中的水平）

①    背景

隨著5hmC在哺乳動物基因組中的發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的bisulfite測序已不能精確區(qū)分5mC和5hmC的修飾差異，傳統(tǒng)BS的測序結果中，5mC的修飾水平實際是5mC和5hmC兩者信號的合集，建立一種精確區(qū)分兩者的實驗技術迫在眉睫。

②    方法

利用oxBS測序技術對小鼠胚胎干細胞DNA甲基化和羥甲基化進行檢測和定量。

③    結論

本研究首次建立了通過化學氧化結合重亞硫酸鹽處理的實驗技術。該技術首先將5hmC氧化為5fC，進而可被重亞硫酸鹽轉換成U，從而排除了5hmC對5mC的信號干擾，達到精確檢測基因組5mC的目的。運用該技術對小鼠胚胎干細胞的研究發(fā)現(xiàn)，5hmC在CGI相關的轉錄調控區(qū)域和LINE1元件中含量較高，表明其對表觀重編程可能起到重要作用。

5mC和5hmC在小鼠胚胎干細胞基因組不同元件的百分量

（3）簡化甲基化測序（RRBS/dRRBS/XRBS）

簡化甲基化測序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利用限制性內切酶對基因組進行酶切，富集啟動子及CpG島等重要的表觀調控區(qū)域并進行重亞硫酸鹽測序。該技術顯著提高了高CpG區(qū)域的測序深度，在CpG島、啟動子區(qū)域和增強子元件區(qū)域可以獲得高精度的分辨率，是一種準確、高效、經(jīng)濟的DNA甲基化研究方法，在大規(guī)模臨床樣本的研究中具有廣泛的應用前景。為了適應科研技術的需要，我們進一步開發(fā)了可在更大區(qū)域內捕獲CpG位點的雙酶切RRBS(dRRBS)，可研究更廣泛區(qū)域的甲基化，包括CGI shore等區(qū)域。

為助力低樣本量多維度分析，我們開發(fā)了富集覆蓋CpG島、啟動子、增強子、CTCF結合位點的甲基化靶向測序方法：extend-ed-representation bisulfite sequencing（XRBS），實現(xiàn)了高靈敏度和樣本復用，使其具有高度可擴展性，并適用于有限的樣本和單個細胞。

技術優(yōu)勢：

l 精確度高：在其覆蓋范圍內可達到單堿基分辨率。

l 重復性好：多樣本的覆蓋區(qū)域重復性可達到85%-95%，適用于多樣本間的差異分析。

l 性價比高：測序區(qū)域針對高CpG區(qū)域，數(shù)據(jù)利用率更高。

研究案例：

DNA Methyltransferase Inhibition Reverses Epigenetically Embedded Phenotypes in Lung Cancer Preferentially Affecting Polycomb Target Genes DNA甲基化的改變對癌癥細胞侵襲能力的影響

①    背景

癌細胞的表型在一定程度上由表觀決定，比如DNA甲基化。癌癥發(fā)展后期的轉移特性可能與表觀遺傳修飾的改變有關。

②    方法

利用RRBS技術檢測具有高侵襲性的非小細胞肺癌細胞系(A549和HTB56)以及相應經(jīng)過甲基化抑制劑氮雜胞苷（azacytidine）處理過的細胞系的甲基化修飾。探討甲基化的改變對肺癌細胞系的侵襲能力的影響。

③    結論

高侵襲性細胞系在發(fā)展過程中，DNA甲基化修飾發(fā)生了廣泛的改變。同低侵襲能力的細胞系相比，RRBS檢測到的CpG富集的區(qū)域中有2.5%的區(qū)域發(fā)生了差異修飾。當使用了DNA甲基化抑制劑azacytidine，伴隨著這些高甲基化修飾的位點出現(xiàn)甲基化修飾的丟失，細胞系的侵襲能力也發(fā)生了逆轉。

5-Azacytidine誘導的侵襲能力逆轉

（4）單/微量細胞全基因組甲基化測序（scWGBS）

單細胞及微量樣本的DNA甲基化組學研究很大程度上受制于建庫測序技術。傳統(tǒng)的文庫構建方法或類似于基因組DNA的單細胞擴增技術很難應用到甲基化實驗過程中。易基因建立了基于線性擴增和單管建庫的技術，可充分降低文庫偏好性，準確的完成珍貴樣本的全基因組甲基化研究。

單細胞及微量珍稀樣本的甲基化研究主要應用于腫瘤發(fā)生機制，癌癥研究，胚胎植入前診斷，胚胎早期發(fā)育，生殖細胞重組，干細胞及細胞異質性等研究領域。應用的樣本包括單細胞、微量細胞等。

技術優(yōu)勢：

l 超低起始量：單細胞或超低的建庫DNA起始量

l 測序覆蓋度高 ：最大限度地獲取完整的全基因組甲基化信息，精確繪制甲基化圖譜

l 單堿基分辨率：可精確分析每一個C堿基的甲基化狀態(tài)

研究案例：

Single-cell DNA methylome sequencing of human preimplantation embryos. 人類植入前胚胎發(fā)育的單細胞DNA甲基化組圖譜

①    背景

在哺乳動物基因組上，胞嘧啶（主要是CpG二連體中的胞嘧啶）在DNA甲基化酶的催化下會發(fā)生甲基化。研究顯示，DNA甲基化對多個生物學過程都至關重要，如基因表達抑制、轉座子轉錄活性調節(jié)、X染色體的失活，以及基因組印記的維持等。此前研究顯示在著床前的早期胚胎發(fā)育過程中只有大規(guī)模的DNA去甲基化。而此次研究數(shù)據(jù)顯示，精子和卵細胞結合受精之后，在人類早期胚胎大規(guī)模DNA去甲基化的同時，也在大量高度特異的DNA從頭加甲基化，這表明在人類早期胚胎第一輪DNA甲基化組重編程過程中，全局的DNA去甲基化'凈結果’實際上是高度有序的大規(guī)模DNA去甲基化和局部DNA加甲基化兩種分子過程相互拮抗產(chǎn)生的動態(tài)平衡的結果。

②    方法

利用單細胞DNA甲基化組高通量測序方法，首次在單細胞分辨率對人類植入前胚胎發(fā)育過程進行了更加深入的分析。

③    結論

在這篇文章中，為了進一步在單細胞水平研究DNA甲基化重編程過程的動態(tài)特征，利用單細胞全基因組DNA甲基化組高通量測序技術，對人類植入前胚胎發(fā)育的各個關鍵階段進行了單細胞、單堿基分辨率的系統(tǒng)研究，主要發(fā)現(xiàn)有：（a）首次發(fā)現(xiàn)了人類植入前胚胎發(fā)育過程中存在大量特異性的DNA從頭加甲基。（b）首次發(fā)現(xiàn)從二細胞胚胎階段開始父母本基因組上的剩余甲基化水平發(fā)生逆轉，在同一個單細胞中母本基因組上的剩余甲基化水平顯著高于父本基因組上的剩余甲基化水平。（c）首次發(fā)現(xiàn)DNA甲基化在早期胚胎卵裂過程中的不對稱分配可以用來追溯同一個胚胎中每個細胞的遺傳譜系。

植入前胚胎不同發(fā)育階段DNA甲基化的動態(tài)變化

（5）擴增子（羥）甲基化測序

擴增子（羥）甲基化技術針對基因組上特定的DNA序列設計甲基化特異性擴增引物（如感興趣的基因等），基因組DNA進行（氧化）重亞硫酸鹽處理后，PCR擴增檢測片段，擴增產(chǎn)物通過二代高通量測序，更精準的檢測基因區(qū)域的甲基化狀態(tài)。

技術優(yōu)勢

l 準確性高：可滿足幾個到上百個基因/CpG 位點的檢測，其覆蓋范圍內可達到單堿基分辨率，覆蓋深度超高（位點平均覆蓋深度>300X）。

l 性價比高：低成本、周期短，超高性價比。

l 針對性強：適用于特定基因或者位點甲基化狀態(tài)的檢測。

l 應用廣泛：廣泛用于臨床樣本多位點的甲基化 Biomarker 篩選、驗證及臨床轉化應用。

研究案例：

Vitamin C Prevents Offspring DNA Methylation Changes Associated with Maternal Smoking in Pregnancy擴增子甲基化測序驗證補充維C可減少后代因母親妊娠期吸煙而發(fā)生的DNA甲基化變化

①    背景

妊娠期吸煙可能導致嬰兒出生后終生肺功能下降。此前已有不少研究描述孕婦吸煙相關的DNA甲基化變化，如在分娩時的胎盤和臍血、胎兒肺以及兒童時期的口腔上皮和血液中。本研究為確定補充維生素C是否會減少后代因母親因妊娠期吸煙而發(fā)生的甲基化變化。

②    方法

對胎盤、臍帶血樣本和口腔樣本進行靶向亞硫酸氫鹽測序，然后使用亞硫酸氫鹽擴增子測序對選定的臍帶血差異甲基化區(qū)域進行獨立驗證。

③    結論

安慰劑組和非吸煙者組之間甲基化差異≥10%的大多數(shù)CpG（69.03%）在補充維生素C處理后，至少50%可恢復到非吸煙者水平?；謴偷腃pG中有相當一部分與低甲基化CpG富集程度較高的表型結果相關。

擴增子甲基化覆蓋的所有321個CpG是平均覆蓋深度的 337 倍

（6）（羥）甲基化DNA免疫共沉淀測序(h)MeDIP-seq

5hmC是新發(fā)現(xiàn)的一種的修飾堿基，由TET家族的酶通過氧化5mC產(chǎn)生的。5hmC不僅能夠降低MeCP蛋白的甲基化結合結構域(MBD) 與甲基化DNA的親和性，具有潛在的參與基因表達調控的轉錄調節(jié)功能，而且參與了DNA去甲基化過程。

羥甲基化DNA免疫沉淀測序（Hydroxymethylated DNA Immunoprecipitation Sequencing，hMeDIP-Seq）是通過運用5'-羥甲基胞嘧啶特異性抗體富集羥甲基化的DNA片段，然后結合高通量測序技術在全基因組水平上以較小的數(shù)據(jù)量，快速、高效地尋找羥甲基化區(qū)域。可廣泛應用于羥甲基化與疾病關系研究以及羥甲基化在胚胎發(fā)育過程中的研究。

技術優(yōu)勢：

l 檢測范圍廣：全基因組范圍鑒定甲基化修飾區(qū)域

l 針對性強：針對性檢測基因組內具有甲基化修飾的區(qū)域

l 成本低：大大降低了測序數(shù)據(jù)量，測序成本低

研究案例：

Genome-wide analysis of 5-hydroxymethylcytosine distribution reveals its dual function in transcriptional regulation in mouse embryonic stem cells 小鼠胚胎干細胞的羥甲基化研究

①    背景

研究證實TET家族蛋白可以催化5mC轉化為5hmC。5mC已經(jīng)被廣泛研究，但對5hmC的分布和功能知道的還很少。

②    方法

利用hMeDIP-seq測序技術對小鼠胚胎干細胞的wild-type和Tet1-depleted type的5hmC進行研究。

③    結論

5hmC在轉錄活性高的基因的gene bodies區(qū)域和受到Polycomb抑制的發(fā)育調節(jié)因子的啟動子區(qū)域；5hmC可能在基因表達調控中起著激活和抑制的雙重功能。

5hmC在全基因組的分布

以上就是目前表觀遺傳學研究領域常用的6種DNA甲基化測序方法，如果您不確定自己適合哪種測序方法，可以留言，可提供設計解決方案參考。

參考文獻：

（1）Ehsan Habibi, et al. Whole-Genome Bisulfite Sequencing of Two Distinct Interconvertible DNA Methylomes of Mouse Embryonic Stem Cells. Cell Stem Cell (2013), 13(3), 360?369.

(2) Booth, M. J., et al. (2012). "Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution." Science 336(6083): 934-937.

(3) Antje Hascher, et al. (2013) DNA Methyltransferase Inhibition Reverses Epigenetically Embedded Phenotypes in Lung Cancer Preferentially Affecting Polycomb Target Genes. Clin Cancer Res; 20(4); 814?26.

(4) Zhu, P., et al. (2018). "Single-cell DNA methylome sequencing of human preimplantation embryos." Nat Genet 50(1):

(5) Shorey-Kendrick LE, et al. Vitamin C Prevents Offspring DNA Methylation Changes Associated with Maternal Smoking in Pregnancy. Am J Respir Crit Care Med. 2017 Sep 15;196(6):745-755.

(6) Wu H,et al. Genome-wide analysis of 5-hydroxymethylcytosine distribution reveals its dual function in transcriptional regulation in mouse embryonic stem cells. Genes Dev. 2011 Apr 1;25(7):679-84.