標題：Regulation of telomere homeostasis and genomic stability in cancer by N6 -adenosine methylation (m6A)

期刊：SCIENCE ADVANCES

IF: 14.136

發(fā)表時間：2021.7.28

技術(shù)平臺：m6A-seq，RNA-seq、ChIP-seq

技術(shù)亮點：m6A

m 6 A甲基化修飾是真核生物mRNA甚至病毒RNA廣泛存在的一種RNA修飾形式。m 6 A修飾早在上世紀70年代就已經(jīng)被報道，但對該修飾在RNA中的整體分布以及其對基因表達調(diào)控的影響一直以來卻知之甚少。2011年，第一個真正意義上的RNA去甲基化酶FTO的報道，使得mRNA/lncRNA的甲基化研究再次進入人們的視野。MeRIP通過m 6 A特異性抗體富集和測序，用于研究RNA的腺苷甲基化修飾。易基因自主研發(fā)微量RNA甲基化檢測技術(shù)，樣本起始量可降低至10-20μg，最低僅需5μg總RNA。

研究背景：

RNA甲基化在癌癥中的作用已在眾多研究中被確認，而m6A是mRNA上最豐富的內(nèi)部修飾。人們普遍認為m6A修飾在mRNA生命周期的幾乎每個方面都發(fā)揮著重要作用，m6A 修飾調(diào)節(jié) mRNA 的穩(wěn)定性、剪接、轉(zhuǎn)運、定位和翻譯。m6A由甲基轉(zhuǎn)移酶復合體（METTL3、METTL14、WTAP）、去甲基轉(zhuǎn)移酶（FTO、ALKBH5）、結(jié)合蛋白（YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1、YTHDC2）等協(xié)同調(diào)控，其中METTL3是影響m6A修飾水平至關(guān)重要的酶。一旦m6A機制改變，可能導致癌癥不受控制的增值、分化、轉(zhuǎn)移和耐藥等。然而這種表觀轉(zhuǎn)錄組學標記在人類癌癥中的作用僅在有限的癌癥類型中有過研究，其潛在機制仍不清楚。另外，尚不清楚特定靶基因m6A水平異常是否會直接導致癌癥發(fā)展。此外，m6A信號改變通常在癌細胞培養(yǎng)中表征，但在人體癌組織中還沒有得到證實。因此臨床樣本的確認將有助于闡明和證實表觀轉(zhuǎn)錄組學在癌癥中的作用。

研究結(jié)果：

1、m6A修飾和RNA甲基轉(zhuǎn)移酶 METTL3 在多種癌癥類型中均上調(diào)

為了充分闡明由METTL3催化的m6A 修飾在癌癥中的作用，作者首先檢測了幾種不同類型癌細胞和對應(yīng)正常細胞在核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）缺失狀態(tài)下RNA中m6A的豐度（圖1A）。結(jié)果顯示癌細胞系中m6A總體水平顯著上調(diào)，在所有受試細胞系中，METTL3的表達模式與m6A總體水平相似（圖1B），表明m6A修飾失調(diào)在癌癥中普遍存在，可能主要歸因于METTL3的異常表達。

為了證實這一結(jié)果，研究人員從原發(fā)性前列腺癌患者中收集了12對癌組織和腫瘤鄰近正常組織樣本，并量化臨床樣本中的m6A總體水平（圖1C）及METTL3表達（圖1D）。結(jié)果顯示與對應(yīng)的正常組織相比，前列腺癌中m6A水平和METTL3表達均顯著上調(diào)。檢測到METTL3的特異性核染色（圖1E），其在癌癥樣本中顯示的信號分布遠強于癌癥鄰近正常組織（圖1F）。免疫組化（Immunohistochemistry，IHC）分析檢測到 METTL3 的特異性核染色（圖1E），且在癌組織樣本中的顯示強度遠高于腫瘤鄰近正常組織（圖1F）。另外，在癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)和肝癌、肺癌患者的單獨隊列中，METTL3表達均呈上調(diào)現(xiàn)象。這些結(jié)果表明，RNA甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3及m6A修飾在人類癌癥中均異常上調(diào)。

圖1

2、HMBOX1是癌細胞中m6A修飾的真正靶點

為了解METTL3催化m6A修飾的致癌機制，作者使用RNA甲基化測序（MeRIP/m6A-seq）繪制了良性永生化前列腺上皮細胞RWPE-1和前列腺癌細胞LNCaP中的m6A圖譜。根據(jù)兩個細胞系m6A水平分布，將MeRIP/m6A序列中所有m6A修飾位點分為三個簇（圖2A）。在

敲除METTL3后在LNCaP細胞系中進行基因表達譜分析，以此確定差異表達基因列表（圖2B）。將RNA-seq測序中確定的METTL3依賴基因與MeRIP/m6A-seq中LNCaP簇的基因重疊，從而產(chǎn)生323個m6A在癌癥中潛在靶點的轉(zhuǎn)錄本（圖2C）。通過檢測這323個候選靶點在活性和非活性METTL3基因中的表達變化，揭示了端粒酶-染色質(zhì)結(jié)合和維持端粒長度所必需的蛋白質(zhì)HMBOX1（homeobox containing 1）在活性和非活性METTL3基因中的差異表達相反（圖2D）。

在MeRIP/m6A-seq數(shù)據(jù)中，前列腺癌細胞LNCaP中HMBOX1的3′UTR區(qū)m6A峰比正常上皮細胞RWPE-1更強（圖2E）。與此同時，在肝癌細胞Huh-7和HepG2、肺癌細胞A549等其他幾種上皮癌細胞系中，同樣的區(qū)域也發(fā)生了甲基化。結(jié)果證實了與正常細胞免疫球蛋白G（IgG）水平下降相比，HMBOX1轉(zhuǎn)錄物在m6A特異性抗體的免疫沉淀中富集，當METTL3在LNCaP、Huh-7或A549細胞中表達沉默時，IgG水平下降程度減少（圖2F）。當METTL3在肝癌細胞系Huh-7（圖2G）和肺癌細胞系A549（圖2H）中被敲除時，HMBOX1則顯著上調(diào)。在異種移植腫瘤中，HMBOX1的mRNA水平（圖2I）和蛋白質(zhì)（圖2J）水平顯著升高，這與體外數(shù)據(jù)研究結(jié)果一致。因此可以得出結(jié)論：HMBOX1是幾種類型癌癥中m6A修飾機制的真正靶點。

圖2

3、TYTHDF2與HMBOX1 mRNA的m6A修飾結(jié)合促進癌細胞中的mRNA降解

研究人員發(fā)現(xiàn)，當LNCaP細胞中METTL3表達沉默時，HMBOX1中的成熟mRNA水平明顯上升，而前體mRNA（pre-mRNA）幾乎沒有變化（圖3A）。使用轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D（ActD）處理LNCaP細胞，并比較正常細胞和METTL3或ALKBH5敲除時HMBOX1 mRNA的半衰期，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當METTL3表達沉默時，HMBOX1 mRNA水平穩(wěn)定，而ALKBH5的敲除則加快HMBOX1 mRNA衰減速率（圖3C）。表明HMBOX1前體mRNA的降解不受METTL3基因敲除的影響。

最近的研究表明，兩種包含YTH結(jié)構(gòu)域的m6A識別蛋白YTHDC2和YTHDF2促進了mRNA修飾的降解。研究人員敲除YTHDF2時，HMBOX1的mRNA和蛋白質(zhì)水平都顯著增加（圖3D，E），敲除YTHDC2對HMBOX1表達的影響非常小。這些結(jié)果表明YTHDF2在HMBOX1 mRNA的m6A依賴性衰變中起著關(guān)鍵作用。接下來研究人員對LNCaP中的MeRIP/m6A序列數(shù)據(jù)進行甲基化（圖3F），并使用基于CRISPR-Cas9的m6A編輯工具進行分析，結(jié)果證明了m6A修飾是導致癌細胞中HMBOX1轉(zhuǎn)錄物衰減的執(zhí)行因子（圖3G,H,I）。

圖3

4、METTL3誘導的HMBOX1降解導致癌細胞端粒功能障礙

HMBOX1此前已被證明可調(diào)節(jié)各種類型腫瘤細胞的端粒長度，因此本研究想驗證癌細胞的端粒長度是否由METTL3-HMBOX1軸控制。研究人員通過定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）檢測早期傳代和晚期傳代細胞的平均端粒長度，并以人類基因組中的單拷貝基因HBG作為數(shù)據(jù)標準化的參考，結(jié)果在LNCaP細胞（圖4A）和A549 細胞（圖4B）中都發(fā)現(xiàn)METTL3過表達細胞中的端粒長度相對比正常細胞短，HMBOX1同時過表達后METTL3對維持端粒長度的抑制作用降低。無論METTL3單獨表達還是與HMBOX1共表達，通過熒光原位雜交（FISH）分析表達METTL3的晚期傳代A549細胞的中期染色體擴散，端粒長度的變化都可以看到（圖4C）。定量分析證實，與正常細胞或HMBOX1共表達細胞相比，METTL3過表達細胞的端粒侵蝕或丟失更為普遍（圖4D）。所有數(shù)據(jù)表明，由于逆轉(zhuǎn)錄酶活性和核糖核蛋白酶復合體關(guān)鍵成分水平的調(diào)節(jié)，METTL3-HMBOX1 軸不太可能調(diào)節(jié)端粒長度。

當敲除HMBOX1時，端粒結(jié)合蛋白TPP1和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶TERT之間的相互作用明顯中斷（圖4E），METTL3過表達細胞的免疫沉淀物中的TERT可以通過重新引入 HMBOX1 來恢復（圖4F）。為觀察METTL3-HMBOX1軸對端粒酶復合物和端粒之間關(guān)聯(lián)的影響，研究人員對METTL3過表達的LNCaP細胞進行內(nèi)源性端粒酶RNA基因（TERC）RNA-FISH檢測和抗TRF2抗體免疫染色，無論有或沒有HMBOX1共表達（圖4G）。同時在正常RWPE-1細胞中進行同樣的分析。分析數(shù)據(jù)證實了功能性端粒酶復合物在癌細胞中重組，促進惡化。

接下來，研究人員使用核糖核酸酶（RNase）-缺陷型Cas13b（dCas13b）建立了另一個可編程的m6A編輯平臺，所有的數(shù)據(jù)都支持m6A修飾HMBOX1需要完整的METTL3活性，足以降低HMBOX1的表達并阻止端粒酶加載到端粒上。數(shù)據(jù)表明，METTL3過表達會干擾端粒酶復合物的正常募集，從而導致癌細胞中端粒的逐漸丟失，而端粒酶復合物是通過m6A誘導的HMBOX1下調(diào)引起的（圖4H,I,J）。最后，研究人員證明了METTL3-HMBOX1軸調(diào)節(jié)癌細胞中端粒酶的端粒募集和端粒長度，從而導致DNA損傷反應(yīng)的參與（圖4K,L）。

圖4

5、METTL3過表達使p53通路失活并通過HMBOX1甲基化在癌細胞中造成染色體不穩(wěn)定性

由功能失調(diào)的端粒誘導的DNA損傷可能導致基因組不穩(wěn)定（癌癥標志），也可能通過靶向DNA修復機制誘導細胞死亡，兩種不同結(jié)果取決于p53信號通路的狀態(tài)。因此研究人員首先檢測了METTL3單獨或與HMBOX1共同過表達的LNCaP細胞中p53的活性（圖5A）。結(jié)果表明METTL3過表達使p53通路失活，而HMBOX1的重新引入完全消除了METTL3對p53信號通路的抑制作用。在肺癌細胞A549中得到了類似的結(jié)果（圖5B）。當HMBOX1在細胞中同時過表達時，p53 蛋白的主要負調(diào)節(jié)因子MDM2被METTL3顯著上調(diào)并恢復到正常水平（圖5C）。

根據(jù)這一結(jié)果和此前在慢性粒細胞白血病細胞K562中發(fā)表的HMBOX1染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）數(shù)據(jù)，研究人員推測MDM2是在癌細胞中被HMBOX1轉(zhuǎn)錄抑制的直接靶基因。為驗證HMBOX1上的m6A修飾參與MDM2表達的調(diào)節(jié)，在基于dCas13b 的m6A編輯平臺中檢查了MDM2基因的前體mRNA和成熟mRNA水平，結(jié)果強有力的證明了HMBOX1上METTL3催化的甲基化破壞了MDM2的轉(zhuǎn)錄抑制，最終導致p53信號通路失活（圖5D,E,F,G），且HMBOX1 可直接抑制MDM2基因的轉(zhuǎn)錄，MDM2基因通過METTL3催化的HMBOX1上的m6A修飾被抑制。

接下來研究人員通過染色質(zhì)定位熒光原位雜交（CO-FISH）技術(shù)分析在癌細胞中METTL3過表達（單獨或與HMBOX1共表達）時，是否存在端粒相關(guān)的染色體畸變。數(shù)據(jù)結(jié)果表明METTL3-HMBOX1軸是癌細胞基因組完整性的決定因素，并且這種特定的表觀轉(zhuǎn)錄失調(diào)將促進染色體不穩(wěn)定性，從而促進腫瘤進展（圖5H,I,J,K）。

圖5

6、METTL3誘導的基因組不穩(wěn)定性導致癌細胞惡性進展，HMBOX1可以緩解這種進展

基于METTL3-HMBOX1 軸在調(diào)節(jié)基因組穩(wěn)定性中的作用，METTL3過表達加速了前列腺癌細胞LNCaP、肝癌細胞Huh-7和肺癌細胞A549的致癌潛能，而這種致癌潛能被HMBOX1的共表達中斷（圖6A）。此外，METTL3過表達顯著增強了LNCaP細胞的轉(zhuǎn)移（圖6B）和侵襲（圖6C）能力，當HMBOX1重新引入細胞時，由METTL3過表達驅(qū)動的侵襲性癌細胞被明顯抑制。研究人員在A549中獲得了類似的結(jié)果（圖6D,E）。結(jié)果表明HMBOX1可以防止METTL3誘導的癌癥惡性進展。

圖6

7、METTL3-HMBOX1軸失調(diào)與癌癥中端粒縮短和基因組不穩(wěn)定性相關(guān)

與METTL3過表達相反，HMBOX1在TCGA數(shù)據(jù)中顯著下調(diào)（圖7A），這在前列腺癌（圖7B）、肝癌（圖7C）和肺癌（圖7D）等各癌癥類型患者中的獨立基因表達譜中得到進一步證實，所有數(shù)據(jù)表明HMBOX1在癌癥中異常下調(diào)。

為驗證細胞培養(yǎng)中的m6A模式是否在人體組織中一致，研究人員在12對原發(fā)性前列腺癌組織和正常鄰近組織中始終發(fā)現(xiàn)前列腺癌中HMBOX1的m6A修飾水平（圖7E）和mRNA表達水平（圖7F）低于正常組織。m6A水平與METTL3表達正相關(guān)，但與HMBOX1表達負相關(guān)（圖7G）。這些結(jié)果共同支持HMBOX1高度甲基化，這可能導致HMBOX1在癌癥中下調(diào)。

最后，研究人員將前列腺癌組織中的端粒長度與METTL3或HMBOX1的表達相關(guān)聯(lián)（圖7H），并對人類癌癥基因組變化進行類似的相關(guān)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在TCGA數(shù)據(jù)集中，METTL3 的mRNA表達水平與HMBOX1表達呈負相關(guān)，但與部分基因組異常變化呈正相關(guān)，兩者均具有統(tǒng)計學意義（圖7I），這種相關(guān)性在肝癌（圖7J）和肺癌（圖7K）中同樣被觀察到。所有數(shù)據(jù)結(jié)果都表明METTL3催化的m6A對某些轉(zhuǎn)錄物（如HMBOX1）修飾在基因組不穩(wěn)定性方面起著非常重要的的作用，這是大多數(shù)癌細胞的共同特征。

圖7

易基因小結(jié)

在這項研究中，作者闡明了表觀轉(zhuǎn)錄組標記 m ⁶ A在控制癌細胞中端粒穩(wěn)態(tài)和基因組穩(wěn)定性中的新作用。得出以下結(jié)論：

（1）m6A修飾和RNA甲基轉(zhuǎn)移酶 METTL3 在多種癌癥類型中均上調(diào)；

（2）HMBOX1是癌細胞中m6A修飾的真正靶點；

（3）YTHDF2結(jié)合m6A修飾促進癌細胞中的HMBOX1 mRNA降解；

（4）METTL3誘導的HMBOX1降解導致癌細胞端粒功能障礙；

（5）METTL3過表達使p53通路失活并通過HMBOX1甲基化在癌細胞中造成染色體不穩(wěn)定性；

（6）METTL3誘導的基因組不穩(wěn)定性導致癌細胞惡性進展，HMBOX1可以緩解這種進展；

（7）METTL3-HMBOX1軸失調(diào)與癌癥中端?？s短和基因組不穩(wěn)定性相關(guān)。

作者通過m6A-seq和RNA-seq、ChIP-seq等多組學測序分析，揭示了癌癥驅(qū)動的基因組改變可能可以通過糾正特定的表觀轉(zhuǎn)錄組調(diào)控來修復，這為癌癥治療提供了一種新方向。

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文獻來源：10.1126/sciadv.abg7073  掃碼獲英文版全文