Comprehensive analysis of ubiquitin-specific protease 1 reveals its importance in hepatocellular carcinoma

泛素特異性蛋白酶1的全面分析顯示其在肝細(xì)胞癌中的重要性

一、研究背景

HCC是最常見(jiàn)的原發(fā)性肝癌。目前研究人員正在關(guān)注肝癌的早期診斷，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的預(yù)防，新預(yù)后標(biāo)志物和治療選擇。然而，晚期HCC患者的治療選擇仍然有限。因此，進(jìn)一步了解HCC發(fā)生發(fā)展機(jī)制非常重要，尋找新的治療靶標(biāo)仍然是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。

泛素化是活性蛋白翻譯后修飾的一種，會(huì)導(dǎo)致腫瘤發(fā)生途徑的抑制或發(fā)展。靶向去泛素酶已被引入作為HCC的一種新型治療方法。然而，還需要更多數(shù)據(jù)來(lái)證明該策略的有效性。USP(半胱氨酸依賴性蛋白酶)，構(gòu)成了去泛素化酶的最大亞家族，在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和DNA損傷反應(yīng)中至關(guān)重要。USP1及其輔助因子USP1相關(guān)因子1(WD重復(fù)結(jié)構(gòu)域48/WDR48)，在DNA損傷反應(yīng)過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用。通常，USP1和WDR48形成一個(gè)復(fù)合體并發(fā)揮功能，WDR48通過(guò)穩(wěn)定其表達(dá)和介導(dǎo)其與底物的接觸來(lái)顯著增強(qiáng)USP1的活性。USP1是有希望的癌癥治療靶標(biāo)。但是，目前對(duì)其在HCC中的作用了解有限。

二、研究思路

三、結(jié)果解析

1、USP1在肝癌中的高表達(dá)

在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘后，與正常組織相比，USP1的mRNA表達(dá)在各種類型的癌癥中均升高，例如肝癌，肉瘤和膀胱癌(圖1A)。然后，進(jìn)一步關(guān)注了它在HCC中的表達(dá)。從4個(gè)數(shù)據(jù)集Roessler Liver，Roessler Liver2，Chen Liver和Wurmbach Liver中選擇了數(shù)據(jù)并對(duì)USP1表達(dá)進(jìn)行了meta分析，從而進(jìn)行四個(gè)研究的比較(圖1C)。

結(jié)果表明，與正常組織相比，USP1在肝癌組織中顯著上調(diào)。在Roessler Liver，Roessler Liver2，Chen Liver和Wurmbach Liver數(shù)據(jù)集中，USP1分別顯示HCC升高2.364倍，2.064倍，1.810倍和1.411倍(圖1B)。此外，使用HPA數(shù)據(jù)庫(kù)分析了USP1蛋白的表達(dá)。大多數(shù)類型的癌癥均表現(xiàn)出USP1陽(yáng)性染色。圖1D顯示了正常肝臟的圖像和HCC肝臟的圖像。在正常肝中未檢測(cè)到USP1，在HCC肝中顯示弱至中度染色。

為了提高結(jié)果的可靠性，使用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步驗(yàn)證了TCGA的LIHC數(shù)據(jù)中USP1 mRNA顯著過(guò)表達(dá)。如圖2A所示，與正常樣品相比，LIHC樣品中USP1的mRNA表達(dá)升高。亞組分析顯示，USP1在肝癌的不同亞組中也被上調(diào)，包括性別，年齡，種族和體重亞組(圖2B-E)。關(guān)于癌癥分期和腫瘤等級(jí)，USP1在1-3期和1-4級(jí)中過(guò)表達(dá)(圖2F，G)。此外，USP1在無(wú)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的HCC患者中過(guò)表達(dá)，而在有轉(zhuǎn)移的患者中則未過(guò)表達(dá)(圖2H)。USP1與TP53突變狀態(tài)呈正相關(guān)且在具有TP53突變的HCC患者中顯著過(guò)表達(dá)(圖2I)。

綜上可得，USP1的高表達(dá)與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)。

2、USP1在HCC患者中的預(yù)后意義

由于USP1的高表達(dá)與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)，于是推測(cè)USP1可以作為HCC患者的預(yù)后標(biāo)志物。使用Kaplan-Meier繪圖儀數(shù)據(jù)庫(kù)評(píng)估了USP1在HCC患者中的預(yù)后意義。USP1高表達(dá)與HCC患者的OS，RFS，PFS和DSS有關(guān)(圖3A-D)。此外，USP1的高表達(dá)還與男性，亞洲人和非飲酒的HCC患者OS不良有關(guān)(圖3E-G)，而女性，白人和飲酒的HCC患者則與OS不良無(wú)關(guān)(圖3I-K)。對(duì)于肝炎病毒感染或非肝炎病毒感染的患者，USP1高表達(dá)預(yù)示其生存期較差(圖3H，L)。總之，USP1高表達(dá)與肝癌患者預(yù)后差有關(guān)。

3、HCC中USP1的突變

在cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)中評(píng)估了USP1在HCC中的突變頻率。選擇了五個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行了分析。USP1在肝癌中的體細(xì)胞突變頻率為0.3％，主要由錯(cuò)義突變組成(圖4A)。此突變頻率相對(duì)較低，每1000個(gè)樣本中只有3個(gè)。因此，未能找到USP1突變與HCC患者的預(yù)后之間的關(guān)系。

在另一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)COSMIC中進(jìn)一步評(píng)估了USP1的突變類型圖4中顯示了兩個(gè)突變類型的餅圖。在大約44.44％的樣本中發(fā)生了錯(cuò)義替換，在11.11％的樣本中發(fā)生了同義替換，在11.11％的樣本中發(fā)生了移碼刪除(圖4B)。取代突變主要發(fā)生在T> C(40.00％)，然后是A> C(20.00％)，A> G(20.00％)和A> T(20.00％)(圖4C)。

4、HCC中USP1表達(dá)與免疫浸潤(rùn)的關(guān)系

使用TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)研究了USP1表達(dá)與免疫浸潤(rùn)的關(guān)系。使用Spearman檢驗(yàn)(使用腫瘤純度進(jìn)行調(diào)整)分析了USP1表達(dá)與六種免疫浸潤(rùn)物(B細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞)豐度之間的相關(guān)系數(shù)。發(fā)現(xiàn)USP1表達(dá)與腫瘤純度有輕微正相關(guān)。此外，USP1表達(dá)與所有六個(gè)免疫浸潤(rùn)物，尤其是嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞有顯著正相關(guān)(圖5)。此外，分析USP1表達(dá)與相關(guān)免疫細(xì)胞基因標(biāo)志物之間的相關(guān)性。與上述結(jié)果一致，USP1與幾乎所有選定的免疫細(xì)胞的基因標(biāo)志物都有顯著的正相關(guān)。其中排名前五位的基因標(biāo)志物是GATA3，CCR8，STAT5B，BDCA-4和STAT1。(表1)

綜上，USP1在HCC發(fā)生過(guò)程中在免疫浸潤(rùn)中起關(guān)鍵作用的結(jié)論。

5、WDR48高表達(dá)與USP1相關(guān)，并預(yù)示肝癌患者預(yù)后不良

為了揭示USP1輔助因子WDR48在肝癌中的作用，評(píng)估了其表達(dá)和預(yù)后意義。使用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)，WDR48在HCC中也明顯過(guò)表達(dá)(圖6A)。根據(jù)已有知識(shí)，WDR48在HCC中的表達(dá)與USP1正相關(guān)(GEPIA，圖6B)。有趣的是，發(fā)現(xiàn)高WDR48表達(dá)還與HCC患者的OS和RFS差有關(guān)(圖6C，D)。

6、與HCC中USP1和WDR48相關(guān)的差異基因

使用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫(kù)和Spearman檢驗(yàn)鑒定與USP1和WDR48相關(guān)的差異表達(dá)基因(圖7A、USP1和不同表達(dá)的基因之間的相關(guān)性，D、WDR48和不同表達(dá)的基因之間的相關(guān)性)。熱圖顯示了前50個(gè)正相關(guān)和前50個(gè)負(fù)相關(guān)的基因(圖7B，C，E，F(xiàn))。根據(jù)Spearman檢驗(yàn)，選擇系數(shù)> 0.4的正相關(guān)基因。

最后，選擇了與USP1正相關(guān)的1175個(gè)基因和與WDR48正相關(guān)的199個(gè)基因。其中98個(gè)基因與USP1和WDR48均呈正相關(guān)，并選擇這些基因進(jìn)行進(jìn)一步分析(圖8A)。將98個(gè)差異表達(dá)的基因輸入到STRING和Cytoscape中以構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(圖8B、98個(gè)基因與最重要的簇的相互作用網(wǎng)絡(luò)顯示為黃色)并使用使用DAVID進(jìn)行GO和KEGG富集分析。分析得到以下生物過(guò)程受到顯著影響：轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，共價(jià)染色質(zhì)修飾等(圖8C)。細(xì)胞成分主要富集于核質(zhì)，核，中心體等(圖8D)。分子功能主要集中在DNA結(jié)合，染色質(zhì)結(jié)合，蛋白質(zhì)結(jié)合等方面(圖8E)。KEGG結(jié)果顯示，共表達(dá)的基因主要參與細(xì)胞周期，醛固酮合成和分泌以及雌激素信號(hào)通路(圖8F)。

7、HCC中的中樞基因的鑒定及其預(yù)后價(jià)值

首先，使用MCODE識(shí)別了PPI網(wǎng)絡(luò)中最重要的簇(圖8B，以黃色顯示)，隨后使用cytoHubba(按等級(jí)排列)確定了網(wǎng)絡(luò)的前十個(gè)中樞基因(圖9A、前十位中樞基因的相互作用網(wǎng)絡(luò))。GO分析結(jié)果表明，生物學(xué)過(guò)程(例如染色質(zhì)重塑，共價(jià)染色質(zhì)修飾和染色質(zhì)結(jié)合)受到顯著影響和富集(圖9B)。最后，在Kaplan-Meier Plotter中評(píng)估了中樞基因的預(yù)后價(jià)值。結(jié)果表明，在這10個(gè)基因中，7個(gè)基因(BPTF，SETD2，SMARCC1，UBXN7，SMC3，PBRM1和SF3B1)的高表達(dá)與不良OS顯著相關(guān)(圖9C，預(yù)后價(jià)值)，而其他三個(gè)基因則無(wú)意義(ATRX，SIN3A和USP34)。

8、驗(yàn)證HCC細(xì)胞系中USP1和WDR48之間的相互作用

首先，使用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)了USP1和WDR48的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)在MHCC97H和SKHep-1中，HCC細(xì)胞系中USP1和WDR48的蛋白質(zhì)水平高表達(dá)(圖10A)。然后，使用靶向USP1的siRNA敲除了這些細(xì)胞系中的USP1。在siRNA-USP1轉(zhuǎn)染后，與NC-siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，USP1在蛋白質(zhì)和mRNA水平上均顯著下調(diào)(圖10B，C，E，F(xiàn))。此外，在MHCC97H和SK-Hep-1細(xì)胞中，USP1敲除顯著降低了WDR48(圖10B，C，E，F(xiàn))。這些結(jié)果通過(guò)特定的USP1抑制劑ML-323進(jìn)一步驗(yàn)證。經(jīng)過(guò)50μmol/ L ML-323處理24小時(shí)后，USP1和WDR48在MHCC97H和SK-Hep-1細(xì)胞中均下調(diào)(圖10D)。此外，使用共免疫沉淀法證實(shí)了HCC細(xì)胞系中USP1和WDR48之間的相互作用，結(jié)果表明USP1與MHCC97H和SK-Hep-1細(xì)胞中的WDR48有相互作用(圖10H）。

9、SiRNA-USP1轉(zhuǎn)染或ML-323處理可降低HCC細(xì)胞的增殖

圖8F表明共表達(dá)的基因主要參與細(xì)胞周期。因此，研究了USP1在HCC細(xì)胞增殖中的作用。

首先，將siRNA-USP1轉(zhuǎn)染到MHCC97H和SK-Hep-1細(xì)胞中進(jìn)行CCK-8測(cè)定以評(píng)估細(xì)胞活力和細(xì)胞增殖能力。結(jié)果表明，USP1基因敲除顯著抑制了MHCC97H和SK-Hep-1細(xì)胞的增殖(圖10G)。USP1敲除后，增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)(USP1/WDR48,44的細(xì)胞靶標(biāo)之一)顯著降低。此外，USP1敲除還降低了細(xì)胞周期蛋白D1和細(xì)胞周期蛋白E1的表達(dá)，從而通過(guò)細(xì)胞周期停滯抑制了肝細(xì)胞的生長(zhǎng)45(圖10C，E，F(xiàn))。此外，ML-323處理還降低了PCNA，cyclin D1和cyclin E1的蛋白表達(dá)。因此，得出結(jié)論，靶向USP1可以減少HCC細(xì)胞的增殖。

四、小結(jié)

USP1在調(diào)節(jié)DNA修復(fù)中具有重要作用，因此被研究人員視為腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)。文章是以問(wèn)題為導(dǎo)向而開展。

• USP1在肝癌中發(fā)生了哪些改變：突變改變，表達(dá)改變或兩者兼有？

• 這些改變是否具有臨床意義，是否與患者的預(yù)后有關(guān)？

• USP1在肝癌中的潛在機(jī)制是什么？

使用信息工具系統(tǒng)地分析USP1在肝癌中的作用并證實(shí)了USP1在肝癌組織中的表達(dá)高于正常組織，且USP1的高表達(dá)顯示出臨床意義，并與HCC患者的不良生存有關(guān)。結(jié)果表明，USP1是肝癌的潛在治療靶標(biāo)。機(jī)制目前仍不清楚。

• 為什么USP1的高表達(dá)與患者的不良生存相關(guān)？

發(fā)現(xiàn)USP1的高表達(dá)與免疫浸潤(rùn)呈正相關(guān)，表明USP1在HCC發(fā)生過(guò)程中在免疫浸潤(rùn)中起關(guān)鍵作用。此外，使用免疫共沉淀法證實(shí)了USP1-WDR48在HCC細(xì)胞中的相互作用。因此，假設(shè)USP1-WDR48復(fù)合物通過(guò)穩(wěn)定底物的活性在肝癌中起關(guān)鍵作用。為了鑒定這些重要的底物，使用GO分析，KEGG富集分析了與USP1和WDR48正相關(guān)的HCC差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能，同時(shí)還識(shí)別了10個(gè)中樞基因，其中7個(gè)基因在HCC患者中具有預(yù)后價(jià)值。這表明，USP1-WDR48復(fù)合物通過(guò)穩(wěn)定和去泛素化這些中樞基因而在肝癌中發(fā)揮了促進(jìn)腫瘤的作用。綜上，USP1的功能取決于其輔助因子WDR48，這給予了開發(fā)特定治療策略的機(jī)會(huì)。本篇文章還證明siRNA -USP1轉(zhuǎn)染或ML-323處理可降低HCC細(xì)胞的增殖。USP1敲除或ML-323處理降低了PCNA，cyclin D1和cyclin E1的表達(dá)，這意味著靶向USP1可以通過(guò)細(xì)胞周期停滯降低HCC細(xì)胞的增殖。

本篇文章也有局限性。首先，用于分析的大多數(shù)數(shù)據(jù)均來(lái)自公共數(shù)據(jù)庫(kù)，并在體外實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證，某些結(jié)果可能需要在未來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。其次，除了USP1的表達(dá)改變外，還應(yīng)注意其活性的改變。但盡管如此，仍可以得出結(jié)論，USP1是治療HCC的有希望的治療靶標(biāo)。

編輯：鄧慧

校審：劉安洋 林安琪