傳播和滲透

在癌癥中，上皮細胞的細胞內(nèi)連接是高分子量治療劑滲透的屏障，會引發(fā)耐藥性。此外，在轉(zhuǎn)移過程中，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化，表型發(fā)生改變，使上皮連接緊密，給治療帶來困難。上皮連接也是一種屏障，阻止OV，尤其是腺病毒的細胞內(nèi)滲透。一些腺病毒，包括HAdV-B3、B14和B14p，可能在感染早期和細胞分裂前通過釋放戊二烯十二面體（Pt-Dd）來克服連接，而不產(chǎn)生Pt-Dd的腺病毒會在同一階段產(chǎn)生大量的纖維蛋白。但是，HAdV-C5仍然是構(gòu)建溶瘤腺病毒最常用的血清型，并且不釋放Pt-Dd。Yumul等人改良的Ad5Δ24可產(chǎn)生上皮連接開放劑（JO），與未修飾的病毒相比，表達JO的溶瘤Ad具有更強的抗腫瘤作用；聯(lián)合應用JO和未經(jīng)修飾的溶瘤腺病毒比單獨注射病毒更能抑制腫瘤生長。JO是一種含有自二聚重組蛋白的HAdV-B3纖維球，其中纖維球的C端被改造以增加其與橋粒糖蛋白2（DSG2）的親和力。DSG2是參與細胞間連接的鈣粘蛋白家族成員，在上皮性腫瘤中過度表達。JO與DSG2結(jié)合后，信號通路激活基質(zhì)金屬蛋白酶ADAM17，引起DSG2胞外區(qū)的分裂和上皮細胞的分離。

細胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）是由蛋白多糖組成的，能夠阻礙瘤內(nèi)腫瘤因子的擴散。ECM 降解酶如松弛素、基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP)-1、-8、-9、軟骨素酶和透明質(zhì)酸酶與 OV共同給藥，或在 GLV-1h255 (VACV) 和 VCN-01 中誘導它們的基因表達 (OAdV) 可以增加 OV 擴散到 TME，并提高 OV在癌癥中的治療效率（圖1）。

如上所述，ECM和細胞連接是OV擴散和擴散的主要障礙。除了蛋白酶，癌細胞凋亡也會促進病毒的傳播。Nagano等人報道，細胞毒性藥物誘導細胞凋亡和caspase-8活化導致腫瘤內(nèi)滲透增加，從而提高溶瘤HSV的抗腫瘤療效；他們認為凋亡癌細胞的收縮或去除產(chǎn)生了通道樣結(jié)構(gòu)和空隙，促進溶瘤性HSV的擴散。

腫瘤靶向

盡管OV具有基于腫瘤細胞上一些過度表達的受體和粘附分子的腫瘤趨向性，但野生OV的腫瘤趨向性還不夠。轉(zhuǎn)基因 OV (Genetically modified OV，GMOV)可以表達對腫瘤相關抗原 (TAA)具有高親和力的受體（圖4）。例如，插入針對人表皮生長因子受體 (HER)-2、上皮細胞粘附分子 (EpCAM) 和癌胚抗原 (CEA) 的單鏈抗體 (scAb) 可以增加OV對腫瘤的特異性。表達 HIV 衍生糖蛋白 (gp)-160 的 VSV 是一種針對白血病和 T 淋巴瘤的特異性 VSV（圖2）。

IFN-I 抗病毒反應的缺陷、腫瘤抑制基因的缺乏，如視網(wǎng)膜母細胞瘤 (Rb) 以及腫瘤細胞中 Ras 信號的增加可引發(fā)腫瘤細胞中 OV 的特異性增殖。插入在腫瘤細胞中高表達的腫瘤特異性啟動子，如前列腺特異性抗原（PSA）和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）啟動子，使得腫瘤細胞中得病毒基因特異性表達。一些微小RNA (miRNA) 在健康細胞中過度表達，而它們在腫瘤細胞中的水平可以忽略不計；因此，通過 miRNA 靶向序列 (miRNA-TS) 靶向這些 miRNA 會破壞正常細胞中的病毒 RNA，而腫瘤細胞中miRNA-TS靶標的低表達導致病毒RNA在腫瘤細胞中保留和復制（圖4）。

HAdV-C5纖維蛋白與許多其他腺病毒和CAR在靶細胞上的相互作用導致病毒penton堿基蛋白上的RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）基序與宿主細胞整合素的相互作用，這種相互作用誘發(fā)網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞作用和病毒進入細胞。由于CAR在許多腫瘤細胞中表達下調(diào)，科研人員對其進行了修飾以增強溶瘤性Ad的向腫瘤性，其中一個提高腺病毒感染效率的修飾是在腺病毒纖維旋鈕結(jié)構(gòu)域的HI環(huán)中插入RGD基序。研究表明，RGD修飾的溶瘤腺病毒治療CAR陰性腫瘤模型可顯著提高感染效率和抗腫瘤活性。另一種針對溶瘤性Ads的策略是使用不同的血清型。Lenman等人發(fā)現(xiàn)HAdV-G52能夠與靶細胞上的聚唾液酸結(jié)合；由于多唾液酸在包括肺和腦在內(nèi)的癌細胞上的高水平表達，使用HAdV-G52作為OV可以優(yōu)先感染相應的癌癥類型。此外，通過抗體單鏈可變片段（scfv）與衣殼蛋白IX（pIX）融合或產(chǎn)生纖維嵌合體的抗體靶向也可用于重定向腺病毒。

另一種將病毒靶向腫瘤細胞的策略是使用雙特異性接合器，它由兩個臂組成，即病毒結(jié)合臂和腫瘤細胞結(jié)合臂，二者通過化學連接或柔性連接件連接在一起。由于多唾液酸（polySia）在包括肺癌在內(nèi)的腫瘤細胞上過度表達，Kloos等人設計了一種包含polySia結(jié)合單鏈抗體結(jié)構(gòu)域和CAR外結(jié)構(gòu)域的雙特異性轉(zhuǎn)接器，以將溶瘤性Ad重新定位到肺癌，發(fā)現(xiàn)用適配器預處理腺病毒載體能有效感染荷瘤小鼠中表達多聚核糖核酸的腫瘤細胞并提高存活率。另一種含有CAR外結(jié)構(gòu)域與CXCL12融合的雙特異性轉(zhuǎn)接器，作為CXCR4趨化因子配體，能夠增強對趨化因子受體陽性癌細胞的感染性，同時降低肝毒性。Nakano等人還開發(fā)了一種由EGFR結(jié)合單鏈抗體和nectin1的N端結(jié)構(gòu)域組成的適配器蛋白，用于將HSV-1定向到EGFR。

免疫反應

使用OV療法的另一個挑戰(zhàn)是由于先前的免疫或感染導致靜脈注射后半衰期短而導致的預先存在的免疫力。用聚合物包被溶瘤腺病毒可以在傳遞過程中保護腺病毒，其中。利用率最高的聚合物是N-（2-羥丙基）甲基丙烯酰胺（HPMA）、聚乙烯甘氨酸和聚酰胺胺。除了延長半衰期外，使用聚合物還可通過修飾溶瘤Ad/聚合物來靶向腫瘤。

另一種保護 OV 免受中和抗體的策略是使用細胞載體作為遞送載體（圖1）。有 3 種主要類型的細胞可用于遞送 OV：免疫細胞、轉(zhuǎn)化細胞和祖細胞。除了攜帶 OV，干細胞還具有定位腫瘤的能力，使之成為有吸引力的載體。在對腫瘤生長至關重要的腫瘤微環(huán)境中，各種生長因子、細胞因子、趨化因子和血管生成因子的表達將干細胞吸引到腫瘤部位。例如，在決定干細胞和祖細胞在腫瘤環(huán)境中的歸巢過程中，缺氧和致瘤因子的上調(diào)至關重要；研究表明，溶瘤腺病毒負載神經(jīng)干細胞（NSC）可增加VEGFR2和CXCR4的表達，從而增加歸巢能力；為避免患者發(fā)生同種異體移植反應，建議使用自體干細胞。然而，值得注意的是，從接受過多輪治療的患者身上分離出來的細胞的質(zhì)量和數(shù)量是可變的。

抗病毒細胞因子（包括不同類型 IFN 在內(nèi)）會阻礙OV復制，進而降低抗腫瘤反應，為了克服這個問題，一些研究使用組蛋白去乙?；?(HDAC) 抑制劑來誘導表觀遺傳的改變并最大限度地減少腫瘤微環(huán)境中的抗病毒細胞因子反應。用丙戊酸鈉（VPA，一種HDAC抑制劑）預處理癌細胞可促進溶瘤HSV復制，但是，研究表明，VPA可抑制病毒感染后腫瘤微環(huán)境中NK細胞和巨噬細胞的浸潤，從而降低抗腫瘤免疫的誘導。此外，HDAC抑制劑還能通過表觀遺傳修飾使基因表達譜向誘導癌細胞阻滯和凋亡方向轉(zhuǎn)變。

對OV的遺傳修飾可以增加細胞因子、趨化因子、共刺激分子、腫瘤細胞外基質(zhì) (ECM) 降解酶和抗血管生成分子的表達，增強其抗腫瘤作用（圖2、圖3）。攜帶粒細胞巨噬細胞集落刺激因子 (GM-CSF) 基因的 OV，如 T-VEC、Pexa-Vec 和 CG0070 能夠募集抗原呈遞細胞 (APC) 和 CTL，從而以最小的抗病毒反應誘導更高效的TAA呈遞。表達促炎細胞因子的GMOV具有增強的抗腫瘤效果。在 OV 中插入 IL-12、IL-15、IL-18、TNF-α、IL-24 和 IFN-γ 基因也能夠增強抗腫瘤作用，且毒性遠低于 IL-2。同時，應用這些細胞因子的非分泌形式僅會引起局部效應，而不會導致全身不良反應。工程化 OV（主要是 VACV）表達的特定趨化因子，如 CCL5、CCL19、CCL20、CCL21，能夠增加初始和記憶 T 淋巴細胞和 DC 向 TME 的浸潤。同時，在OV中使用一個或多個共刺激配體，包括CD40L、4-1BBL、OX40L和B7-1，例如LOAd703（CD40L和4-1BBL的組合）可以增加抗原呈遞和T細胞啟動。此外，在 OV 基因組中插入 TLR 配體（如富含 CpG 的區(qū)域）能夠刺激 TLRs 并進一步激活先天性和獲得性免疫。

增強 TME 中免疫反應的另一種方法是消除免疫抑制細胞。表達羥前列腺素脫氫酶 (HPGD) 的 GMOV 使 PGE2 失活并減少 TME 中的MDSC。GMOV表達的可溶性CXCR4作為誘餌受體與腫瘤細胞分泌的CXCL12結(jié)合，抑制CXCL12對MDSCs的血管生成、轉(zhuǎn)移和募集的作用。盡管 OV可以通過各種機制釋放 TAA，但 GMOV 表達 TAA 或?qū)?TAA 衍生肽包覆在 OV 表面會增加 T 細胞反應并改善 OV治療。迄今為止，已經(jīng)研究了大量的 TAA和肽。肽包被相對于肽表達的優(yōu)勢是方便、快速、成本更低，并且在肽包被方法中可以針對每位患者進行個性化。OV 可以被設計以表達促凋亡蛋白，如 TNF 相關的凋亡誘導配體 (TRAIL) 和可誘導腫瘤細胞特異性凋亡的凋亡素；在 OV 中插入小干擾 RNA (siRNAs) 也可以抑制癌基因表達并抑制腫瘤生長。

2',5'-寡腺苷酸合成酶 (OAS)-RNase L系統(tǒng)和 RNA 依賴性蛋白激酶 (PKR)也能夠限制病毒感染。在響應病毒感染產(chǎn)生 I 型干擾素后，雙鏈RNA激活 OAS-1、-2、-3 基因的轉(zhuǎn)錄，導致 RNase L 激活，最終降解病毒和單鏈 RNA。除此之外，用雙鏈 RNA 和 I 型 IFN 系統(tǒng)感染細胞會激活PKR。PKR 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可磷酸化真核起始因子2 α (eIF2 α) 的α亞基。eIF2 α 的磷酸化使其處于非活性狀態(tài)并抑制病毒蛋白的合成。Jha 等人的研究表明，用舒尼替尼（一種 PDGF-R 和 VEGF 抑制劑）進行預處理可增強溶瘤病毒療法的療效，對體內(nèi)外抗病毒酶RNase L和PKR均有抑制作用。此外，貝伐單抗（一種血管內(nèi)皮生長因子的抑制劑）也可以增加溶瘤腺病毒的擴散，可能是因為貝伐單抗降低了間質(zhì)液體壓力。此外，抗血管生成藥物與OV聯(lián)用具有協(xié)同作用，通過抑制血管生成，從而抑制腫瘤生長所必需的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的供應，增強腫瘤內(nèi)OV的復制和擴散。

缺氧效應

缺氧是實體瘤的一個特征，發(fā)生在腫瘤的發(fā)育和生長過程中，會導致細胞周期停滯，可能會影響 Ad和任何其他依賴于細胞周期進程的病毒的復制能力。為了克服缺氧對腺病毒復制的抑制，并利用缺氧條件進行靶向，Clarke等設計了一種溶瘤腺病毒，其中E1A基因的表達由含缺氧反應元件的啟動子控制，改良的溶瘤腺病毒獲得了在缺氧條件下充分復制的能力。

2009 年的兩個課題組（Aghi 等，F(xiàn)asullo 等）的研究表明缺氧環(huán)境增強了溶瘤性 HSV 的病毒復制，這可能與 HSV 對氧細胞減少或氧衍生的自由基誘導的 DNA 損傷（刺激 HSV 復制）的天然趨向性有關。此外，參與 HSV 復制的幾個基因的轉(zhuǎn)錄被缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）激活。感染 AF2240（一種溶瘤 NDV）使得 HIF-1 α 在缺氧條件下降解，從而導致不同癌細胞系中 HIF-1 α 靶基因的下調(diào)。其他病毒（包括水泡性口炎病毒和痘苗病毒）也能夠在缺氧條件下增強它們的復制。

OV治療的生物安全性

除腫瘤細胞外，一些OV也可能在正常細胞中復制并引起損傷。例如，T-VEC可能仍然會導致潛在的感染并引起長期的神經(jīng)系統(tǒng)不良事件（AE）。使用對人類致病性低的OV，如細小病毒和呼腸孤病毒，通過重復傳代削弱OV或刪除毒力基因，可以增加OV療法的安全性。胸苷激酶 (TK) 和受感染細胞蛋白 (ICP)34.5 基因在 VACV 和 HSV-1 復制中起著至關重要的作用，此類基因的產(chǎn)物在腫瘤細胞中含量豐富，因此缺乏這些基因的GMOV可以在腫瘤細胞中復制，而病毒在健康細胞中的復制則由于此類產(chǎn)物的低表達而受損。GL-ONC1 和 Pexa-Vec (JX-594) 是不含 TK的 VACV，T-VEC、HSV-1716 和 G207 是不含 ICP34.5 的 HSV，在臨床試驗中顯示出較好的安全性。野生 ZIKA 病毒在膠質(zhì)母細胞瘤中具有溶瘤潛力，但也會感染具有嚴重并發(fā)癥的正常神經(jīng)，從其基因組的 3' 去除 10 個核苷酸可以在不降低溶瘤活性的情況下提高安全性。AdV 中 E1 基因的突變或缺失，以及痘病毒中 TK、痘苗生長因子 (VGF)、血凝素和 B18R 基因的缺失會降低正常細胞中 OV 的毒力。然而，刪除毒力基因以增加安全性有時會降低 OV 的抗腫瘤活性。

將安全的 OV（如 NDV）與高效的 OV（如 VSV）重組是提高 OV 安全性的另一種方式。重組 VSV-NDV (rVSV-NDV) 包含來自 NDV 的包膜內(nèi)容和 VSV 的原始骨架。AdV 與危害較小的柯薩奇病毒或細小病毒的重組構(gòu)成了在不損害正常細胞的情況下在腫瘤細胞感染中具有高效力的 OV；使用埃博拉病毒 (EBOV) 糖蛋白還可降低 rVSV-EBOV 中 VSV 的神經(jīng)毒性。然而，GMOV 和野生型 OV 的天然同源重組可能會導致轉(zhuǎn)基因和致病性病毒。此外，OV療法在接受放療和化療的免疫受損個體以及孕婦中的安全性仍存在爭議。

給藥途徑

影響OV反應的因素之一是給藥方式。腫瘤內(nèi)注射可精確控制 TME 中的 OV 濃度，從而獲得更好的治療效果，然而，瘤內(nèi)注射的復雜性限制了給藥的重復性。靜脈注射因其便利性、可重復性和靶向轉(zhuǎn)移灶的可能性而廣受歡迎，但需要腫瘤特異性遞送系統(tǒng)并且更有可能引起全身毒性。腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)/顱內(nèi)和胸膜內(nèi)注射分別適用于靶向腹腔內(nèi)器官、中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS) 和肺部腫瘤，但僅限于在實驗室動物中使用。最佳的給藥途徑仍然是一個爭論的問題，沒有具體的指導方針。似乎口服/粘膜和鼻腔給藥等較不具攻擊性的給藥途徑，至少對胃腸道和腦惡性腫瘤而言，可以提高患者的可接受性，應在未來的研究中加以考慮。

患者選擇

哪些患者適合治療？目前尚未確定可靠的預測性生物標志物，可以預測對溶瘤病毒療法有反應的患者。另一方面，由于大多數(shù) OV 的實驗性質(zhì)，接受溶瘤病毒治療的患者通常已經(jīng)經(jīng)歷了多次常規(guī)癌癥治療，他們的免疫系統(tǒng)被破壞，腫瘤與其初始形式相比發(fā)生了根本性的改變。Zloza 等人設計了一項研究，測量了黑色素瘤患者在溶瘤痘苗病毒治療前后外周血單個核細胞基因表達的變化。微陣列數(shù)據(jù)顯示，病毒給藥后，分別有 301 和 960 個基因上調(diào)和下調(diào)。進一步的分析表明，免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄物 2 可用作溶瘤痘苗病毒治療患者的治療生物標志物；而在另一項研究中，高遷移率組框 1 被建議作為溶瘤腺病毒治療的預測和預后生物標志物。

圖1 規(guī)避OV臨床試驗障礙的策略

（A）促進病毒在腫瘤內(nèi)的擴散。表達透明質(zhì)酸酶（HD）的OV能夠分解ECM中的HA，增強OV在腫瘤內(nèi)擴散性。（B）使腫瘤細胞對OV療法敏感。分泌促凋亡蛋白的OV可逆轉(zhuǎn)腫瘤對OV療法的耐藥性。（C）優(yōu)化OV轉(zhuǎn)運。載體細胞保護OV免受免疫系統(tǒng)損傷，增強OVs的腫瘤靶向性。（D）OV介導的免疫治療。OV介導的溶瘤促進免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的反應，提高整體治療反應。

圖2 溶瘤病毒治療的新方法

圖3 細胞因子/趨化因子東武裝得溶瘤病毒

圖4 OV的遺傳修飾

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