寫在前面：

本次更新主要介紹文庫構(gòu)建完成后對目標(biāo)文庫的富集方法——“雜交捕獲法”，這一期小編將重點介紹雜交捕獲法的實驗流程及其作用。

1.為什么進行雜交捕獲？

在文庫構(gòu)建完成后，若是做全基因組測序（Whole Genome Sequencing，WGS），可直接將構(gòu)建好的文庫按照一定的濃度、測序深度、數(shù)據(jù)量進行上機測序即可。但在實際的操作中，由于人的基因組中存在大量豐富的重復(fù)DNA序列，且考慮到測序成本的問題，所以通常會進行靶向測序，即選擇我們需要的區(qū)域進行測序，比如全外顯子測序（Whole-exome sequencing，WES），或者針對腫瘤患者設(shè)計的特定的Panel測序等（一個Panel指包含所有探針的一個集合，eg：一個Panel里包含200個探針，200個探針的集合就是一個Panel）。那么如何獲得所需的目標(biāo)區(qū)域或者靶序列呢？就需要探針與靶序列進行雜交，然后再通過捕獲雜交片段的方法進行目標(biāo)區(qū)域的富集。

2. 實驗流程&作用

2.1  雜交準(zhǔn)備

雜交需要投入的原料：

①一定量的文庫：可以是一個文庫或者多個文庫，多個文庫的話可根據(jù)不同的接頭序列區(qū)分每個樣本；

②Human Cot DNA：封閉大量重復(fù)的DNA序列，避免非特異性雜交；

③Universal Blockers：封閉接頭序列，避免非特異性雜交；

④不同的Panel：生物素標(biāo)記的探針，主要負責(zé)與靶序列雜交；

⑤雜交Buffer、雜交Enhancer、NF水等（圖中未展示）；

注：雜交原料進行雜交時，由于雜交體積限制，都會進行體積濃縮，常用到的是采用真空濃縮的方法；此外還有磁珠法濃縮；針對不同的濃縮方法，各種雜交原料的加入順序有一定的差異。

真空濃縮法：①+②+③→真空濃縮→+④+⑤→雜交。

磁珠濃縮法：①+②+④→磁珠濃縮→+③+⑤→雜交。

真空濃縮法在小Panel雜交的過程中表現(xiàn)比磁珠濃縮法較好，但磁珠濃縮法更簡便快捷，成本更低。

2.2 雜交

95℃將文庫變性為單鏈狀態(tài)；

65℃進行雜交；

注：A&C：表示探針與靶序列雜交；B&D表示未雜交。

2.3 捕獲

通過鏈霉親和素磁珠與生物素標(biāo)記的探針特異性結(jié)合，再利用磁珠和磁鐵之間的相互作用“抓”出靶標(biāo)片段。

2.4 洗脫

該步驟主要是洗掉一些非特異性雜交的片段（65℃熱熱洗脫），以及未雜交的片段、多余探針、雜交Buffer、雜交Enhancer 等雜質(zhì)，只保留與探針雜交的靶序列。

2.5 PCR擴增&純化

通過PCR擴增對靶片段進行富集，PCR循環(huán)數(shù)根據(jù)Panel的大小而定（一般Panel較大擴增循環(huán)數(shù)較少，相反則較多）。

2.6 文庫質(zhì)檢

①文庫濃度：常用的是Qubit法對雜交文庫濃度進行測定。

②文庫質(zhì)量：常用的是Agilent 2100測定雜交文庫的片段大小范圍。

文庫質(zhì)檢與上機測序密切相關(guān)。

待續(xù)

小編后續(xù)會介紹雜交捕獲過程中非特異性雜交的情況，同時會繼續(xù)從每個步驟詳細介紹NGS的流程。

今天來個小插曲→ 實驗室的故事1

下面是一段來自實驗室的對話：

A：一邊做著實驗一邊對B說，我等會兒要做到恒溫孵育了，幫我開一下孵育箱；

B：好的；

過了一會兒

A：走到孵育箱前一直笑，發(fā)現(xiàn)孵育箱的“門”確實是B幫忙打開了。