什么是Phasing？

Phasing，或者說(shuō)Genotype Phasing，它的中文名有很多：基因定相、基因分型、單倍體分型、單倍體構(gòu)建等在不同的語(yǔ)境下都有人說(shuō)過(guò)。但不管如何，所謂Phasing就是要把一個(gè)二倍體（甚至是多倍體）基因組上的等位基因（或者雜合位點(diǎn)），按照其親本正確地定位到父親或者母親的染色體上，最終使得所有來(lái)自同一個(gè)親本的等位基因都能夠排列在同一條染色體里面。

現(xiàn)在流行的NGS測(cè)序技術(shù)，都是把序列打亂混在一起測(cè)序的，測(cè)完之后，我們是無(wú)法直接區(qū)分這些序列中哪一個(gè)是父源，哪一個(gè)是母源的。我們通常都只是檢測(cè)出基因組上有哪些變異，以及這些變異的堿基組成（純合、雜合），也就是平時(shí)所說(shuō)的基因型（Genotype）。只有經(jīng)過(guò)Phasing，才能夠?qū)崿F(xiàn)這個(gè)區(qū)分（圖1）。

圖1. 變異位點(diǎn)經(jīng)過(guò)Phasing和不經(jīng)過(guò)Phasing的示意圖。右上圖代表通常的Genotype，右下圖代表Phasing之后的情況，實(shí)現(xiàn)了親本的區(qū)分。

為什么要Phasing

因?yàn)镻hasing很重要。Phasing的重要性可以分為兩個(gè)方面。一方面, Phasing與遺傳變異的功能詮釋密切相關(guān)。這體現(xiàn)在遺傳咨詢師或者科學(xué)家需了解基因突變的相位后, 才能更好地判斷基因突變是否會(huì)產(chǎn)生臨床表型。比如在一個(gè)基因上發(fā)生多個(gè)Loss of function variants(LOF)，通常當(dāng)這些變異出于不同的單倍型時(shí)(這稱為trans-configuration)，即兩個(gè)拷貝的姐妹基因都發(fā)生了變異, 才會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)計(jì)量(Gene expression dosage)的錯(cuò)誤且產(chǎn)生危害。而當(dāng)它們出于同一個(gè)單倍型時(shí)(這稱為cis-configuration)，因?yàn)檫€有一個(gè)正?？截惖幕颍ㄗ鳛閭涮ィ? 基因表達(dá)很可能不會(huì)發(fā)生改變也不會(huì)產(chǎn)生危害。

另一方面, Phasing在遺傳學(xué)研究中也有諸多應(yīng)用，具體如下：

• 第一、人群Phasing后形成的單倍型參考序列集(Reference panel)是基因型推斷（Imputation）必須的數(shù)據(jù)材料。而基因型推斷（Imputation）是基因型-表型關(guān)聯(lián)分析研究中必不可少的環(huán)節(jié)。高質(zhì)量的Reference Panel能提升關(guān)聯(lián)分析的統(tǒng)計(jì)功效；

• 第二、除了Reference Panel的制造需要使用Phasing技術(shù)之外，對(duì)被研究的對(duì)象進(jìn)行預(yù)先Phasing(Pre-phasing)也可以極大地提高基因型推斷（Imputation）的準(zhǔn)確性；

• 第三、使用多個(gè)位點(diǎn)組成的Haplotype，而不是簡(jiǎn)單的單位點(diǎn)基因型, 可實(shí)現(xiàn)群體遺傳歷史的推斷；

• 第四、可通過(guò)Phased后的家系人群?jiǎn)伪缎托蛄校浪闳旧w重組率、重組熱點(diǎn)等重要遺傳參數(shù)；

• 第五、Phasing可用于探測(cè)頻發(fā)突變、選擇信號(hào)以及基因表達(dá)的順勢(shì)調(diào)控。

Phasing說(shuō)起來(lái)容易，做起來(lái)卻很難

雖然Phasing理解起來(lái)并不難，但實(shí)現(xiàn)起來(lái)卻不容易，即使在理論上也是如此。這需要相關(guān)的統(tǒng)計(jì)學(xué)和計(jì)算機(jī)算法技術(shù)，求解的過(guò)程往往還是一個(gè)NP問(wèn)題。目前通常采用馬爾科夫鏈蒙特卡洛算法來(lái)完成，因此，Phasing算法本身基本都是計(jì)算密集型的，做起來(lái)也比較耗時(shí)間，有時(shí)即使是在超算集群中也得跑很長(zhǎng)時(shí)間。

Phasing的方法有哪些

Phasing的方法總結(jié)起來(lái)主要有三個(gè)：家系分型(Related individuals Phasing)、群體LD分型(LD Phasing)和物理分型(Physical Phasing)下面我就來(lái)逐一展開(kāi)對(duì)其方法進(jìn)行說(shuō)明。

目前，基因定相最準(zhǔn)確的方法是利用家系數(shù)據(jù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。具體來(lái)說(shuō)，就是除了被研究的這個(gè)個(gè)體之外，同時(shí)對(duì)其父親和母親的基因組進(jìn)行測(cè)序。有了這三個(gè)人的數(shù)據(jù)之后，就可以很容易地區(qū)分出這個(gè)樣本的兩個(gè)單倍體。為了便于理解，我打個(gè)比方，比如我們知道他/她的基因組某一個(gè)位置上的基因型是AB，而父親的基因型是AA，母親的基因型是BB，那么我們就可以清楚地知道他/她這個(gè)基因上的A是來(lái)自于父親染色體，而B(niǎo)則是屬于母親染色體的，更多的具體情況可以參看下面這個(gè)示意圖。

圖2. 家系數(shù)據(jù)實(shí)現(xiàn)對(duì)子/女基因組的Phasing示意圖

這個(gè)方法的一大優(yōu)點(diǎn)就是定相（Phasing）的過(guò)程非常直接、簡(jiǎn)單，不需要進(jìn)行復(fù)雜的統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算，就可以準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)距離的定相，并且還能夠知道每一個(gè)基因型的親本來(lái)源到底是什么，比如在上面的例子中，我們可以知道A和B分別屬于父本和母本（如上圖）。這個(gè)親本來(lái)源的問(wèn)題對(duì)于研究或者治療許多復(fù)雜疾病的意義是十分重大的，比如最近發(fā)表在《Science》上的一個(gè)研究中發(fā)現(xiàn)，影響小孩發(fā)生孤獨(dú)癥（也稱自閉癥）的基因突變中父親的影響更大，除此之外還有很多母源或者父源性的疾?。ㄟ@里面其實(shí)還涉及到Transmitted和Non-Transmitted Chromosome的問(wèn)題），這些類型的結(jié)果如果沒(méi)有家系的數(shù)據(jù)是無(wú)法得出的。

對(duì)于這個(gè)方法來(lái)說(shuō)，家系越龐大它的Phasing效果會(huì)越好。萬(wàn)一很不幸我們沒(méi)能湊齊一家三口（Trio樣本）僅有雙樣本的情況，也不用灰心，雖然效果會(huì)差一些，但還是會(huì)比沒(méi)有任何族譜信息的數(shù)據(jù)要好。

家系Phasing的這個(gè)方法雖有很多難以比擬的好處，但也有一些比較明顯的缺點(diǎn)。比如，我們?yōu)榱藢?duì)這個(gè)人進(jìn)行定相分析，就不得不多測(cè)另外兩個(gè)人的基因組。這一方面大大增加了原有的成本；另一方面則是有些人由于各種各樣的原因已經(jīng)難以獲取其雙親的樣本數(shù)據(jù)了；另外，這個(gè)方法其實(shí)也無(wú)法完成對(duì)該個(gè)體所有變異的完全定相，比如當(dāng)碰到父、母和子/女都是雜合突變的位點(diǎn)時(shí)，就無(wú)法區(qū)分了。這樣的位點(diǎn)雖然在基因組上不是最主要的，但是也大約占到了總變異位點(diǎn)數(shù)的13%左右，或者說(shuō)有大約五分之一的雜合突變位點(diǎn)（注意只是占所有雜合的比例）是這種不可Phasing的狀態(tài)，詳細(xì)的分類情況可以參考下表：

表1. 能夠被Phasing和不能夠被Phasing的SNPs位點(diǎn)分類

LD Phasing是另外一個(gè)非常常用的基因定相方法，它是利用群體中大量無(wú)血緣關(guān)系的個(gè)體，依據(jù)基本的連鎖不平衡(Linkage disequilibrium，LD)遺傳原理和相關(guān)數(shù)學(xué)模型，推斷群體中每個(gè)個(gè)體的單倍體的方法，因此它也是計(jì)算量最大的一個(gè)。

我們知道人這個(gè)物種在減數(shù)分裂產(chǎn)生生殖細(xì)胞的過(guò)程中姐妹染色單體會(huì)發(fā)生重組，這個(gè)重組的發(fā)生率每代大約是10^-8，雖然很低，但是隨著一代接一代不斷地繁衍下去，經(jīng)過(guò)足夠長(zhǎng)的時(shí)間之后（比如說(shuō)無(wú)窮！無(wú)窮！無(wú)窮?。?。

你這是在逗我嗎

那么從理論上來(lái)講，來(lái)自同一祖先的兩條染色就會(huì)被均勻地重組一個(gè)遍。然而，遺憾的是我們現(xiàn)代人還是Too Youg Too Simple！從最早的證據(jù)來(lái)看現(xiàn)代人的共同祖先大概起源于15萬(wàn)-19萬(wàn)年前（第三次走出非洲的時(shí)間），所以至今我們也不過(guò)才經(jīng)歷了6,000-7,600代而已。

這么少的代數(shù)也就意味著染色體的重組其實(shí)還很有限，因此人類基因組中許多相鄰的區(qū)域往往都是“黏”在一起遺傳下去的，這也就是所謂的存在連鎖不平衡的遺傳現(xiàn)象，這些“黏”在一起的區(qū)塊稱為“連鎖不平衡區(qū)塊”（LD Block）。

常見(jiàn)變異——那些在人群中頻率占比達(dá)到5%以上的變異——所存在的連鎖不平衡區(qū)塊(LD Block，Tajima’s D > 0.5)的長(zhǎng)度大多集中在50Kbp－60Kbp。并且LD區(qū)塊的長(zhǎng)度在不同的人群中是不同的，比如，非洲人的LD區(qū)塊就比歐洲人和亞洲人的更短。為什么呢？這是因?yàn)榉侵奕吮葰W洲人或者亞洲人都要更古老，他們的基因組相比于另外的兩個(gè)人群發(fā)生了更多次數(shù)的重組，所以LD區(qū)塊的長(zhǎng)度就更短了。

LD區(qū)塊的存在就意味著我們可以通過(guò)構(gòu)建相關(guān)的數(shù)學(xué)模型，來(lái)把這樣的連鎖關(guān)系求解出來(lái)。在開(kāi)展大規(guī)模的基因組研究計(jì)劃時(shí)（如Hapmap、國(guó)際千人基因組、Haplotype reference consortium以及各國(guó)家的國(guó)家基因組計(jì)劃），通過(guò)構(gòu)建基于隱馬爾可夫模型（HMM）等的Phasing算法就可以依據(jù)測(cè)序數(shù)據(jù)或者芯片數(shù)據(jù)，反推出每個(gè)個(gè)體最有可能的單倍體，完成Phasing。

目前，適合于以上兩種Phasing方法（家系和LD Phasing）的最好工具是Beagle和Shapeit。這兩個(gè)工具都同時(shí)包含了用于家系（Related individual Phasing）和LD Phasing的模塊。并且都可以用于測(cè)序數(shù)據(jù)和芯片數(shù)據(jù)，但其中的差別在此不贅述。

回過(guò)頭來(lái)想想LD Phasing方法的缺點(diǎn)是什么？其實(shí)通過(guò)上面的介紹，我想大家或多或少也注意到了，由于這個(gè)方法需要依據(jù)群體的信息，那么它所能夠Phasing的精度就會(huì)受到群體的制約。通常來(lái)說(shuō)它只能針對(duì)群體中常見(jiàn)的變異（如頻率在5%以上的變異），在這方面它的效果確實(shí)非常棒，很多基因檢測(cè)公司甚至?xí)堰@個(gè)作為公司產(chǎn)品的買點(diǎn)，但對(duì)于罕見(jiàn)突變和個(gè)體特有的變異就不行了。雖然隨著人群基數(shù)的增大，它所能夠Phasing的變異范圍也會(huì)隨著不斷增加，比如從只能Phasing 5%以上頻率的變異，增大到能夠Phasing 1%以上頻率的變異，但說(shuō)到底它還是難以實(shí)現(xiàn)對(duì)一個(gè)個(gè)體單倍體的完全定相。

那么，到底該怎么做才能實(shí)現(xiàn)完全定相呢？

正所謂，求人不如求己。由于有了以上的種種限制，于是科學(xué)家們就研發(fā)了第三類方法：Physical Phasing——「物理定相（或叫物理分型）」。它不需要家系數(shù)據(jù)，也不借助LD關(guān)系，完全依賴自身的測(cè)序數(shù)據(jù)，就可以完成基因的定相。

我們都知道在第二代或者三代測(cè)序中，一條read、一對(duì)reads或者一個(gè)clone上的每一個(gè)堿基都必定來(lái)自同一個(gè)染色體（也就是同一個(gè)單倍體）。對(duì)于每一個(gè)這樣的測(cè)序片段而言，它本身就是某一個(gè)單倍體的一個(gè)“局部”，因此現(xiàn)在的問(wèn)題就變成了要如何把這些一個(gè)一個(gè)的小”局部“連成一個(gè)整體，接出完整的單倍體，從而實(shí)現(xiàn)定相，這就是Physical Phasing。而且如果測(cè)序序列足夠長(zhǎng)(比如三代測(cè)序數(shù)據(jù))，深度足夠深，那么它就能夠?qū)崿F(xiàn)個(gè)體的完全定相，而且有必要的話還可以同時(shí)把這兩個(gè)單倍體的完整DNA序列組裝出來(lái)，形成姐妹染色單體，這兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)是另外兩個(gè)方法難以比擬的。

長(zhǎng)序列可以來(lái)自特殊建庫(kù)，如長(zhǎng)度約是40Kbp的Fosmid建庫(kù)后的測(cè)序和組裝，或者是華大測(cè)序儀的Long Fragment Read(LFR)測(cè)序技術(shù)，當(dāng)然也可以是第三代測(cè)序的數(shù)據(jù)。

這也是我（礦工）在華大基因深度負(fù)責(zé)的第一個(gè)研究課題（我的博士論文也是基于該課題）。當(dāng)時(shí)這一塊還比較空白，第三代測(cè)序技術(shù)也還不是很成熟，當(dāng)時(shí)為了獲得長(zhǎng)序列，我們采用了基于Fosmid構(gòu)建大長(zhǎng)度克隆片段然后進(jìn)行二代測(cè)序并組裝的方法（如下圖），成果發(fā)表在2015年的《Nature Biotechnology》上，我也是共同第一作者。

圖3. 基于Fosmid和二代測(cè)序技術(shù)相結(jié)合的de novo Phasing方法

由于我當(dāng)時(shí)已經(jīng)為課題中的一些細(xì)節(jié)寫過(guò)兩篇文章，因此這里就不再展開(kāi)，感興趣的話你也可以查看本文最后的推薦閱讀，這里我只介紹物理定相的基本原理?？偟膩?lái)說(shuō)，要把局部的小片段連成一個(gè)大片段，從而實(shí)現(xiàn)Phasing，這個(gè)過(guò)程要做的好就需要充分借助小片段上的雜合SNPs作為區(qū)分的標(biāo)記。通過(guò)每個(gè)雜合位點(diǎn)上各個(gè)小片段中所含堿基的異同和彼此之間的重疊關(guān)系，我們可以把絕大部分的小片段分成兩類，然后通過(guò)一系列的連接、二分圖構(gòu)建、二分圖求解和重新組裝等方法，最后就可以把小片段逐步連成大片段，從而構(gòu)建出單倍體了，如下圖（請(qǐng)橫著看）。

圖4.物理定相示意圖

物理定相的方法，往往要求每個(gè)片段中都能包含較多的雜合SNPs位點(diǎn)，但由于人類基因組中雜合SNPs位點(diǎn)之間的距離普遍在1.5Kbp左右——還是比較長(zhǎng)的，因此測(cè)序片段本身就要足夠長(zhǎng)，這就需要使用包括三代測(cè)序技術(shù)在內(nèi)的一些測(cè)序方法，因此它的成本會(huì)比較高。我目前所知道的在Physica Phasing方面做得比較好的機(jī)構(gòu)中，除了我們自己當(dāng)時(shí)的小組之外，還有德國(guó)的馬克普朗克研究所（ Max Planck Institute）Margret教授團(tuán)隊(duì)和華大基因Brock Peters博士所在的研究組，他們建立了LFR的實(shí)驗(yàn)和信息方法。

小結(jié)

關(guān)于Phasing原理的介紹到此就告一段落了，這里在介紹LD Phasing和物理定相的時(shí)候沒(méi)有從數(shù)學(xué)原理方面去展開(kāi)，希望可以看起來(lái)比較通俗易懂，并且所有的Phasing算法都只對(duì)二倍體基因組比較有效，多倍體更加困難。在實(shí)際的項(xiàng)目中，我們還是需要根據(jù)樣本的特點(diǎn)、測(cè)序策略和結(jié)果預(yù)期，有針對(duì)性地選擇其中的一種或者多種進(jìn)行組合，從而達(dá)到最有效的Phasing效果，評(píng)價(jià)Phasing效果好壞的指標(biāo)有兩個(gè)：

• 第一，能夠被Phasing的變異位點(diǎn)越多越好；

• 第二，正確被Phasing的位點(diǎn)數(shù)占比越高越好。