PRM（平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)，Parallel Reaction Monitoring）目前靶向蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)采集的主流方法，通過(guò)對(duì)特異性肽段或目標(biāo)肽段（如發(fā)生翻譯后修飾的肽段）進(jìn)行選擇性檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)/修飾肽段的靶向相對(duì)或絕對(duì)定量。

PRM技術(shù)原理

        平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)(Parallel Reaction Monitoring,PRM) 是一種基于高分辨、高精度質(zhì)譜的離子監(jiān)視技術(shù)，能夠?qū)δ繕?biāo)蛋白質(zhì)、目標(biāo)肽段（如發(fā)生翻譯后修飾的肽段）進(jìn)行選擇性檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)/肽段的定量。首先利用四級(jí)桿質(zhì)量分析器的選擇檢測(cè)能力，在一級(jí)質(zhì)譜中選擇性地檢測(cè)目標(biāo)肽段的母離子信息。隨后，在collision cell中對(duì)母離子進(jìn)行碎裂；最后利用高分辨、高質(zhì)量精度分析器在二級(jí)質(zhì)譜中檢測(cè)所選擇的母離子窗口內(nèi)的所有碎片的信息。這樣即可對(duì)復(fù)雜樣本中的目標(biāo)蛋白質(zhì)/肽段進(jìn)行準(zhǔn)確地特異性分析。

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技術(shù)優(yōu)勢(shì)

1. 靈敏度、重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度高，定量范圍可達(dá)到5個(gè)數(shù)量級(jí)

2. 不需要使用抗體，獲得更為準(zhǔn)確和重現(xiàn)的定量驗(yàn)證結(jié)果

3. 在一個(gè)小時(shí)檢測(cè)時(shí)間內(nèi)可同時(shí)實(shí)現(xiàn)50個(gè)蛋白質(zhì)的定量檢測(cè)

4. 可直接檢測(cè)二級(jí)所有離子，減少了子離子的挑選和優(yōu)化過(guò)程

樣品要求

應(yīng)用方向

• 驗(yàn)證定量蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果，驗(yàn)證翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果

• 目標(biāo)蛋白質(zhì)相對(duì)定量分析，目標(biāo)蛋白質(zhì)絕對(duì)定量分析

• 診斷標(biāo)志物靶向篩選；診斷標(biāo)志物驗(yàn)證與絕對(duì)定量；驗(yàn)證基因表達(dá)產(chǎn)物

案例解析

PRM技術(shù)定量蛋白磷酸化修飾

        該文章通過(guò)定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)得到癌癥病人樣品中的蛋白磷酸化的變化，然后用PRM技術(shù)對(duì)挑選出的目標(biāo)蛋白磷酸化位點(diǎn)的變化進(jìn)行更精準(zhǔn)地定量和驗(yàn)證。

磷酸化定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

        本項(xiàng)研究采用的是乳腺癌患者的血漿樣品，通過(guò)超高速離心方法從人血漿樣品中分離出微囊泡和外泌體，進(jìn)行蛋白質(zhì)提取和胰酶消化，獲得的多肽采用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)Label free方法，比較正常人和乳腺癌患者血漿微囊泡和外泌體中蛋白磷酸化的差異變化（圖1）。

                                       圖1  磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)流程

        本研究對(duì)微泡和外泌體蛋白組的定量分析顯示，大多數(shù)蛋白在正常人和癌癥患者中的蛋白質(zhì)表達(dá)非常相似（圖2），但患者血漿中微泡和外泌體蛋白質(zhì)的磷酸化更多，表明乳腺癌患者磷酸化差異并不是蛋白質(zhì)表達(dá)變化的結(jié)果，并且更有潛力成為標(biāo)志物。

                                                圖2   磷酸化蛋白組（左）和蛋白組（右）的火山圖

PRM技術(shù)驗(yàn)證癌癥患者的特異性磷酸化

        為了驗(yàn)證乳腺癌患者微囊泡和外泌體中蛋白磷酸化成為潛在標(biāo)志物的可能性，研究人員采用了PRM技術(shù)進(jìn)行了后續(xù)驗(yàn)證。PRM驗(yàn)證階段共選擇了4個(gè)磷酸蛋白：RALGAPA 2、PKG 1、TJP2和NFX 1，對(duì)13例癌癥患者(8例)和7例健康對(duì)照者(另加1例)的血漿EV（包括微囊泡和外泌體）進(jìn)行定量測(cè)定。從圖3可以看出，乳腺癌患者的RALGAPA 2、PKG 1和TJP2水平明顯高于對(duì)照組。然而，與Label free定量蛋白組學(xué)分析結(jié)果相比，在PRM中蛋白差異倍數(shù)明顯減小，特別是NFX 1磷酸化僅在乳腺癌標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)，而在健康對(duì)照組中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。

                                                                           圖3  PRM技術(shù)對(duì)潛在標(biāo)志物的驗(yàn)證

小結(jié)

        本研究通過(guò)采用Label free技術(shù)分析了癌癥病人血漿微囊泡和外泌體中的磷酸化蛋白組差異，再利用PRM技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，證實(shí)了血漿微囊泡和外泌體中RALGAPA 2、PKG 1和TJP2蛋白的磷酸化變化可以作為乳腺癌診斷的潛在標(biāo)志物。

        華盈生物可以提供蛋白質(zhì)組學(xué)一站式服務(wù)，整合蛋白質(zhì)組學(xué)篩選(Label free、iTRAQ、TMT、DIA)和PRM驗(yàn)證服務(wù)，幫助研究人員系統(tǒng)性解決蛋白組學(xué)研究中各環(huán)節(jié)的技術(shù)問(wèn)題。

相關(guān)文獻(xiàn)

1. Wang Z，et al. iTRAQ-based proteomic analysis reveals key proteins affecting muscle growth and lipid deposition in pigs. Sci Rep. 2017 Apr 24;7:46717.

2. Dozio V，et al. Characterisation of extracellular vesicle-subsets derived from brain endothelial cells and analysis of their protein cargo modulation after TNF exposure. J Extracell Vesicles. 2017 Apr 19;6(1):1302705.

3. Kim HJ, et al. Quantitative Profiling of Protein Tyrosine Kinases in Human Cancer Cell Lines by Multiplexed Parallel Reaction Monitoring Assays. Mol Cell Proteomics. 2016 Feb;15(2):682-91.

4. Majovsky P, et al. Targeted proteomics analysis of protein degradation in plant signaling on an LTQ-Orbitrap mass spectrometer. J Proteome Res. 2014 Oct 3;13(10):4246-58.