突破“不可成藥”限制，小核酸藥物引領(lǐng)生物制藥新浪潮

劉得光3p6n6zqq 2021-11-25

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2021年11月23日/醫(yī)麥客新聞 eMedClub News/--在去年新冠疫情爆發(fā)后，mRNA疫苗的高效研發(fā)帶動了整個核酸藥物領(lǐng)域的高速發(fā)展，受到越來越多人的關(guān)注。國內(nèi)外資本瞄準(zhǔn)其龐大的市場空間及發(fā)展?jié)摿?，紛紛布局，核酸藥物的研發(fā)成為全球最炙手可熱的領(lǐng)域之一。

與傳統(tǒng)的小分子藥物和抗體藥物相比，核酸藥物最大的優(yōu)點是研發(fā)時間大幅縮短，只需通過核酸序列設(shè)計的改變，就可以快速研發(fā)出不同的藥物。其中的細(xì)分領(lǐng)域—寡核苷酸（小核酸）藥物作為mRNA技術(shù)平臺之外的另一匹黑馬，得到了爆發(fā)式的增長，寡核苷酸通常由12-30個核苷酸單鏈或雙鏈組成，可分為反義寡核苷酸（ASOs)、小干擾RNA（siRNA）和微小RNA（miRNA）等。

小核酸藥物的發(fā)展歷程

最早的核酸藥物可以追溯到20世紀(jì)70年代。1978年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)ASO可與靶標(biāo)mRNA結(jié)合形成DNA/RNA雙鏈，進(jìn)而降解mRNA，使其喪失功能。1998年，第一款A(yù)SO藥物獲批，用于治療CMV視網(wǎng)膜炎。2004年第一款RNA aptamer藥物獲批，siRNA核酸藥物迎來了研發(fā)熱潮，多家大型企業(yè)紛紛進(jìn)入這一領(lǐng)域，但siRNA因其在人體內(nèi)不穩(wěn)定、易降解以及潛在的免疫原性等問題導(dǎo)致小核酸藥物研發(fā)一度擱淺。

直到2013年，各種化學(xué)修飾技術(shù)的蓬勃發(fā)展推動了小核酸藥物的進(jìn)展。2016年，F(xiàn)DA先后批準(zhǔn)了2款A(yù)SO藥物上市。2018年，世界上首款siRNA藥物patisiran獲FDA和EC批準(zhǔn)用于臨床治療。2019年，givosiran作為第二款siRNA藥物獲FDA批準(zhǔn)上市。2020年，為了應(yīng)對新冠疫情，F(xiàn)DA緊急授權(quán)使用了兩款mRNA疫苗。

▲圖1：小核酸藥物的發(fā)展歷程

寡核苷酸的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)

與科研研發(fā)測試不同，小核酸藥物所需的劑量通常需要高達(dá)μmol到mmol級別，常規(guī)的化學(xué)合成方法已無法滿足生產(chǎn)需求，在產(chǎn)業(yè)中通用的方法為固相合成法，整個反應(yīng)由4個步驟組成：分別為脫保護(hù)、偶聯(lián)、氧化和加帽：

脫保護(hù)：
使用二氯乙酸或者三氯乙酸的二氯甲烷溶液去除去核苷酸上的5'-DMT保護(hù)基團(tuán)，暴露5'-OH，以供下一步偶聯(lián)。
偶聯(lián)：
在這一步核苷酸鏈得到延伸，亞磷酰胺單體與活化劑四唑混合并進(jìn)入合成柱，形成亞磷酰胺四唑活性中間體，脫保護(hù)的5'-OH與亞磷酰胺四唑活性中間體形成新的磷氧鍵，并脫去四唑。
氧化：
偶聯(lián)反應(yīng)生成的亞磷酯鍵，易被酸、堿水解，因此需將此處三價磷氧化（硫化）為五價的磷。被氧化后形成的磷酸二酯（或硫代膦酸二酯）鍵。磷酸二酯鍵（或硫膦二酯）上有一個2-氰乙基保護(hù)，該保護(hù)基可以使磷酸二酯鍵在后續(xù)的合成中更穩(wěn)定。
加帽：
雖然偶聯(lián)的效率可以達(dá)到99%以上，但仍有一些已經(jīng)脫保護(hù)的5'-OH沒有參與反應(yīng)。為了防止這些5'-OH與下一個循環(huán)加入的亞磷酰胺單體發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生N-1雜質(zhì)。需要對未參與偶聯(lián)的5'-OH加帽。一般常用乙酸酐和N-甲基咪唑形成乙?；噭c未參與偶聯(lián)反應(yīng)的5'-OH形成酯鍵。

▲圖2：寡核苷酸固相合成4步循環(huán)法

在寡核酸合成時，另外一個需要考慮到的就是對于核酸的修飾，為了讓寡核苷酸可以被更好的遞送到細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，通常需要在合成時對寡核苷酸的主鏈、核糖或者核堿基進(jìn)行修飾。常見的修飾方法有：對主鏈骨架的修飾、對堿基的修飾、對2-OH核糖的修飾和核糖的修飾以及對替代化學(xué)物的修飾。此外，寡核苷酸偶聯(lián)其他分子物質(zhì)也是在合成中常見的修飾方法。

寡核苷酸合成儀

目前所有的合成和修飾過程都可以直接借助寡核苷酸合成儀自動合成，但由于中間涉及到多種試劑和復(fù)雜的合成步驟，自動化水平及系統(tǒng)穩(wěn)定性成為了衡量寡核苷酸合成儀的重要指標(biāo)，其中的翹楚，來自Cytiva（原GE生命科學(xué)）Oligo系列寡核苷酸合成儀。下方是?KTA oligopilot plus的一些具體參數(shù)：

?KTA oligopilot plus允許使用多達(dá)12種不同的合成單體，自動合成多達(dá)七個不同的寡核苷酸序列，除此之外，我們還可以看到其他的一些特點：

▲圖3：?KTA oligopilot plus

合成方法和規(guī)模的靈活性
可使用磷酸二酯和/或硫代磷酸酯DNA、RNA寡核苷酸
更加經(jīng)濟(jì)
酰胺消耗量更低
產(chǎn)生廢棄物顯著減少
單體溶液的再循環(huán)生產(chǎn)
高通量
1 μmol合成所需的循環(huán)時間低于5分鐘
可放大的簡單平臺
可以依次合成多達(dá)七個寡核苷酸
不同生產(chǎn)規(guī)模的合成儀使用同一個控制系統(tǒng)Unicorn
放大生產(chǎn)無需額外的方法優(yōu)化
過程分析技術(shù)(PAT)的在線監(jiān)測
可以對電導(dǎo)率、UV-vis和壓力進(jìn)行在線監(jiān)測

總結(jié)

小核酸藥物作為一個新的生物制藥技術(shù)平臺，現(xiàn)今已進(jìn)入到成熟階段，它展示出的顛覆性技術(shù)的特質(zhì)，將會改變慢性病的治療理念和策略。今后十年甚至二十年內(nèi)都是核酸制藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個重大窗口期。未來，新一代核酸藥物必然會成為藥物研發(fā)的主流方向！