RNAi就是利用降解雙鏈RNA的酶系統(tǒng)，人工引入一段和目標(biāo)RNA互補(bǔ)的序列，這樣，在細(xì)胞內(nèi)形成雙鏈RNA，誘發(fā)降解機(jī)制，使目標(biāo)RNA降解，無法被進(jìn)一步翻譯。

在轉(zhuǎn)染過程中，有人就在擔(dān)心，dsRNA的穩(wěn)定性是相對于單鏈RNA而言的！RNA怎么辦？

RNAi中，標(biāo)準(zhǔn)的非修飾的siRNA確實(shí)容易降解，這不僅在保存過程中，而且在轉(zhuǎn)染過程中。對siRNA的降解，可以合成修飾的雙鏈siRNA，以提高合成中的穩(wěn)定性，使用合成好的siRNA。

不管是什么樣的RNA實(shí)驗(yàn)，最基本的一點(diǎn)就是要嚴(yán)防RNase！盡量嚴(yán)格做到不要受RNA酶的污染。可以用高溫變性、DEPC等處理使RNase失活就好了！
所以還是勤快點(diǎn)的好！

對轉(zhuǎn)染來說，因?yàn)橐佑|血清，培養(yǎng)基以及細(xì)胞內(nèi)酶的作用。這時(shí)，好的轉(zhuǎn)染試劑作用就顯現(xiàn)出來了。要做到在血清中游離時(shí)，保護(hù)siRNA不受培養(yǎng)基中酶和蛋白的降解、吸附等影響，同時(shí)在進(jìn)入細(xì)胞后不被溶酶體降解，并能釋放到細(xì)胞質(zhì)中。好的轉(zhuǎn)染策略還不僅有保護(hù)的作用，更重要的是濃縮siRNA，不將細(xì)胞外的其他成分，特別是毒性成分，如抗生素、過多的蛋白帶入細(xì)胞，以避免細(xì)胞產(chǎn)生毒性反應(yīng)，毒性對RNAi實(shí)驗(yàn)來說，影響非常大。

做RNAi干擾用siRNA還是shRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染需要根據(jù)您的試驗(yàn)綜合考慮。

1.選擇siRNA的優(yōu)缺點(diǎn)

選擇siRNA只能瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，作用周期短，但是siRNA相對與shRNA操作簡便，試驗(yàn)周期短，轉(zhuǎn)染效率一般優(yōu)于shRNA，主要是優(yōu)于siRNA分子特性決定的，siRNA轉(zhuǎn)染優(yōu)化一般使用熒光標(biāo)記的siRNA,在熒光倒置顯微鏡下觀察熒光的強(qiáng)弱以及分布。熒光特異性比較弱。

2.選擇shRNA的優(yōu)缺點(diǎn)

選擇shRNA可以瞬轉(zhuǎn)也可以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，作用周期較長，需要構(gòu)建載體，操作稍微復(fù)雜與siRNA,試驗(yàn)周期較長，轉(zhuǎn)染效率與您的轉(zhuǎn)染手段以及細(xì)胞類型有關(guān)。一般用GFP或者Luc檢測轉(zhuǎn)染效率。

不管是原代細(xì)胞還是別的類型細(xì)胞這兩種方法都是可以選擇，根據(jù)您的試驗(yàn)需要進(jìn)行選擇。不論siRNA還是shRNA做原代轉(zhuǎn)染，需要優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，特別轉(zhuǎn)染試劑選擇以及轉(zhuǎn)染手段上需要經(jīng)驗(yàn)。如果轉(zhuǎn)染效率還是比較低的話可以選擇用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選。