導(dǎo) 讀

當(dāng)前，高通量測(cè)序技術(shù)（NGS）在腫瘤基因突變檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用，但新技術(shù)的廣泛應(yīng)用也給臨床檢測(cè)規(guī)范化帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)。在規(guī)范化NGS實(shí)驗(yàn)室建立和使用的過(guò)程中，首先需要考慮“人員”、“設(shè)備”、“物料”、“方法”以及“環(huán)境”五個(gè)要素，以保證每一例樣本檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本篇推文主要從“環(huán)境”這一要素，介紹NGS實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化布局以及基本儀器設(shè)備配置。

※ 文章素材來(lái)源于李金明《高通量測(cè)序技術(shù)》。

本區(qū)應(yīng)為潔凈區(qū)域，用于配制試劑、儲(chǔ)存試劑及消耗品。若其他區(qū)污染通過(guò)空氣流入該區(qū)域內(nèi)，將影響后續(xù)操作流程和最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所以需獨(dú)立成區(qū)。此外，該區(qū)還需設(shè)置正負(fù)壓緩沖間，避免實(shí)驗(yàn)室內(nèi)外空氣流通。后續(xù)各區(qū)域的緩沖間設(shè)置原則同該區(qū)一樣。

本區(qū)為半污染區(qū)，用于樣本DNA提取及其定量和濃度檢測(cè)。起始DNA模板的質(zhì)量和測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性緊密相關(guān)，需嚴(yán)格遵循防污染要求，避免下游擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)其污染。

若樣本為福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）樣本，還需設(shè)置標(biāo)本制備前區(qū)，用于標(biāo)本切片和HE染色。

本區(qū)為半污染區(qū)，用于樣本DNA片段化。人類基因組DNA長(zhǎng)度過(guò)長(zhǎng)，而NGS檢測(cè)的DNA片段范圍在200~300bp左右，所以在文庫(kù)制備前需要進(jìn)行片段化處理，常用的有超聲打斷的物理方法。

若空間有限，可在標(biāo)本制備區(qū)專門(mén)劃分打斷區(qū)域，但需注意打斷后的樣本不在該區(qū)域開(kāi)蓋轉(zhuǎn)管，以免污染其他DNA模板，同時(shí)做到定期清潔打斷區(qū)。

本區(qū)為半污染區(qū)，用于構(gòu)建文庫(kù)。DNA經(jīng)片段化處理后產(chǎn)生粘性末端，需先修復(fù)補(bǔ)平為平末端，并在3'端加上“A”尾。之后，再在片段兩端加上接頭和標(biāo)簽。若接頭或標(biāo)簽出現(xiàn)污染，導(dǎo)致樣本間數(shù)據(jù)錯(cuò)分，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性也無(wú)法保證。

當(dāng)標(biāo)本量較少，且標(biāo)簽是通過(guò)DNA連接酶的非PCR反應(yīng)加上的，則標(biāo)本制備區(qū)和文庫(kù)制備區(qū)可合并。

本區(qū)為半污染區(qū)，用于文庫(kù)的預(yù)擴(kuò)增和純化。文庫(kù)擴(kuò)增涉及PCR過(guò)程，產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物的氣溶膠，需獨(dú)立成區(qū)。

本區(qū)為半污染區(qū)，用于捕獲目的序列。

本區(qū)為半污染區(qū)，用于對(duì)捕獲后的文庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)對(duì)終文庫(kù)的濃度和片段大小進(jìn)行檢測(cè)以及測(cè)序文庫(kù)的pooling工作。

本區(qū)為半污染區(qū)，用于文庫(kù)上機(jī)測(cè)序。房間溫度控制在18~22℃，2小時(shí)溫度波動(dòng)應(yīng)小于2℃；濕度保持在20%~60%；避免人為引起的震動(dòng)。

本區(qū)為半污染區(qū)，用于檢測(cè)提取后的DNA和超聲打斷后的DNA片段分析。

規(guī)劃好各功能區(qū)后，還需配備相應(yīng)的儀器設(shè)備，同時(shí)做上明確標(biāo)記，避免不同區(qū)域間的設(shè)備發(fā)生混淆，造成交叉污染。

圖2 各分區(qū)所需基本儀器設(shè)備 

注：A. 基本儀器配備；B. 樣本制備室專用移液器

然而，臨床檢測(cè)項(xiàng)目繁多，涉及不同的檢測(cè)流程以及檢測(cè)平臺(tái)，那如何將這些項(xiàng)目進(jìn)行整合，實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室的合理有效布局呢？

以同時(shí)開(kāi)展病原體檢測(cè)、腫瘤基因突變組織學(xué)樣本和ctDNA樣本檢測(cè)項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)室為例。所使用的檢測(cè)平臺(tái)包括qPCR、一代測(cè)序（Sanger測(cè)序）和二代測(cè)序（illumina雜交捕獲靶向測(cè)序）。

圖3 多檢測(cè)項(xiàng)目、多檢測(cè)平臺(tái)共存情況下的NGS實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)

相比于單檢測(cè)項(xiàng)目、單檢測(cè)平臺(tái)而言，多檢測(cè)項(xiàng)目、多檢測(cè)平臺(tái)共存情況下的NGS實(shí)驗(yàn)室布局要復(fù)雜一些，除了要遵循上述分區(qū)原則，還要合理規(guī)劃現(xiàn)有空間，最大限度防止污染發(fā)生，保證日常檢測(cè)工作的順利進(jìn)行。

為避免潛在生物安全風(fēng)險(xiǎn)，單獨(dú)設(shè)置標(biāo)本制備三區(qū)，用于病原體DNA的提取。

ctDNA濃度低且檢測(cè)靈敏度高于組織樣本，為避免樣本間交叉污染，ctDNA樣本和組織樣本需分別設(shè)置標(biāo)本制備區(qū)、文庫(kù)制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)和雜交捕獲區(qū)來(lái)完成DNA提取和文庫(kù)制備過(guò)程。

在共用區(qū)域操作時(shí)，一定要注意防污染，如加樣時(shí)，使用帶濾芯的槍頭而非普通吸頭，減少由于吸樣時(shí)氣溶膠產(chǎn)生所致的交叉污染；或是樣本經(jīng)瞬時(shí)離心后再開(kāi)蓋；混勻樣本用渦旋振蕩方式或輕彈方式代替吹打方式等。

本區(qū)為潔凈區(qū)，不涉及樣本核酸，可作為三種檢測(cè)項(xiàng)目的共享區(qū)域。

因三種檢測(cè)平臺(tái)原理不同，故擴(kuò)增四區(qū)除了用于組織樣本文庫(kù)擴(kuò)增和富集，同時(shí)也可作為Sanger測(cè)序PCR反應(yīng)和產(chǎn)物純化以及病原體qPCR檢測(cè)分析區(qū)。

由于二代測(cè)序文庫(kù)帶有特定的接頭以及Index標(biāo)簽序列，可與一代測(cè)序上機(jī)樣本區(qū)分開(kāi)，二者不會(huì)產(chǎn)生交叉污染，因此二代測(cè)序上機(jī)和一代測(cè)序上機(jī)可放在同一區(qū)域內(nèi)。

電泳區(qū)用于電泳檢測(cè)一代測(cè)序擴(kuò)增產(chǎn)物和二代測(cè)序判斷核酸質(zhì)量、片段大小分析等步驟的公共區(qū)域。

綜上所述，NGS實(shí)驗(yàn)室規(guī)范化布局的根本目的是為了提供物理上的阻隔，防止各區(qū)域間的交叉污染。在實(shí)際工作中，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室需要依據(jù)實(shí)際情況“量體裁衣”，以保障檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

參考資料：

李金明. 高通量測(cè)序技術(shù). 第一版. 北京：科學(xué)出版社，2018.

           本期介紹的“NGS實(shí)驗(yàn)室布局”就到這里啦，如想了解

更多資訊，請(qǐng)持續(xù)關(guān)注我們~