福爾馬林固定石蠟包埋樣本（FFPE）因其易于長(zhǎng)期保存，所以在臨床病理檢驗(yàn)、腫瘤基因檢測(cè)和醫(yī)學(xué)科學(xué)研究過(guò)程中多采用此種方法保存患者的組織樣本。在利用二代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行精準(zhǔn)治療時(shí)，很大程度上依靠這些組織樣本。

然而，由于腫瘤的異質(zhì)性和正常細(xì)胞的干擾，腫瘤體細(xì)胞突變往往難以被發(fā)現(xiàn)。雖然二代測(cè)序技術(shù)可以進(jìn)行深度測(cè)序，找到低頻突變，但有證據(jù)表明，在FFPE DNA樣本中檢測(cè)到的一些序列突變可能是樣本處理過(guò)程中遭受損傷所致^[1]。

為了減少序列假象（sequence artifacts）對(duì)腫瘤突變檢測(cè)結(jié)果的影響，首先我們來(lái)了解一下DNA損傷有哪些類型。

圖1 FFPE DNA中存在的DNA損傷^[2]

（來(lái)源：Do, H. et al. | Clinical Chemistry ）

即大分子（如蛋白質(zhì)和核酸）兩兩之間發(fā)生交聯(lián)。甲醛導(dǎo)致DNA損傷的原因主要源自其羰基親電性和較小的空間位阻，使其易于與核酸和蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)。在體外，甲醛先與蛋白質(zhì)或核酸上自由的氨基反應(yīng)生成不穩(wěn)定的羥甲基加合物，然后再進(jìn)一步與其他核酸或蛋白質(zhì)反應(yīng)形成穩(wěn)定的交聯(lián)物^[3]。

在上述甲醛導(dǎo)致的各種交聯(lián)類型中，主要形成DNA和組蛋白的交聯(lián)。這一過(guò)程是甲醛先快速的和組蛋白反應(yīng)，然后再和DNA外環(huán)的氨基結(jié)合形成DPC（即DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)）。

在FFPE DNA樣本中存在C>U或C>T。在體內(nèi)，胞嘧啶自發(fā)水解脫氨變成尿嘧啶，發(fā)生頻率約為每個(gè)細(xì)胞每天190次，可通過(guò)堿基切除修復(fù)恢復(fù)成胞嘧啶，而在體外則無(wú)法修復(fù)。此外，CpG二核苷酸中的胞嘧啶水解脫氨，轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶，產(chǎn)生T:G錯(cuò)配。

DNA分子丟失了嘌呤堿或嘧啶堿后形成的脫堿基位點(diǎn)。當(dāng)組織在福爾馬林中固定時(shí)，福爾馬林中的甲醛在空氣中容易被氧化成甲酸，甲酸降低了福爾馬林的pH值。而嘌呤堿基與糖骨架的N-糖苷鍵易于在低pH下發(fā)生水解，致使DNA堿基脫落。此外，脫堿基位點(diǎn)可以通過(guò)β-消除反應(yīng)進(jìn)行自發(fā)切割，導(dǎo)致DNA鏈斷裂。

FFPE DNA的片段化程度會(huì)隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)和固定中使用的福爾馬林pH值的降低而增加。與來(lái)自新鮮FFPE DNA相比，保存時(shí)間長(zhǎng)的FFPE DNA進(jìn)行PCR，成功率較低。說(shuō)明樣品在保存期間，DNA片段化這一現(xiàn)象可能一直在發(fā)生。

那么，想要獲得高質(zhì)量的FFPE DNA，我們可以從以下方面“解救”DNA。

1.1 中性福爾馬林固定液

正如前文中提到的，甲醛pH降低容易導(dǎo)致堿基脫落，甚至是DNA斷裂。有研究表明，將乳腺癌組織樣本同時(shí)用中性緩沖福爾馬林固定液和非緩沖福爾馬林固定液處理，發(fā)現(xiàn)用中性福爾馬林固定液處理過(guò)的樣本DNA片段化較少^[4]。同時(shí)，中性緩沖福爾馬林固定液也可降低DNA交聯(lián)的發(fā)生?；诖耍覀兺扑]使用10%中性福爾馬林固定液對(duì)組織樣本進(jìn)行固定。

圖2 不同福爾馬林緩沖液制備乳腺癌FFPE 

DNA的QC比率對(duì)比

（來(lái)源：Nagahashi, M. et al. | Journal of Surgical Research）

注：QC比率表示DNA質(zhì)量的相對(duì)量度。

高QC比率表示DNA片段化較少，反之亦然。

組織固定，組織塊不宜過(guò)大。凡是需要固定的組織，都不應(yīng)該太大太厚，這是因?yàn)樗械墓潭ㄒ捍┩噶Σ粔驈?qiáng)、浸透度不夠快的緣故。如果較大較厚的組織，不經(jīng)處理就進(jìn)行固定，那么待固定液進(jìn)入至中間，可能這些組織早就發(fā)生自溶了。一般所取組織塊厚度建議不超過(guò)5mm。

固定液量的足夠與否決定著組織固定的成敗，推薦固定液體積應(yīng)為被固定標(biāo)本體積的5～10倍。根據(jù)標(biāo)本的大小選擇合適的體積。若標(biāo)本過(guò)大，可取些脫脂棉或紗布，浸濕固定液后，蓋于組織表面，以免組織被風(fēng)干，影響制片效果。

組織樣本固定的時(shí)間通常不超過(guò)48小時(shí)，根據(jù)組織樣本的體積控制固定時(shí)間。通?；顧z標(biāo)本為 6～24 h；手術(shù)切除標(biāo)本為 12～48 h^[5]。極小的標(biāo)本，如穿刺樣本建議固定時(shí)間在4～6 h。對(duì)于后續(xù)要進(jìn)行二代測(cè)序的標(biāo)本，固定時(shí)間不足，組織自溶，核酸酶釋放，核酸隨之降解；若固定時(shí)間太久，核酸與核酸、核酸與蛋白產(chǎn)生過(guò)多的交聯(lián)，在后續(xù)解交聯(lián)步驟后核酸產(chǎn)生較多損傷，通過(guò)PCR擴(kuò)增，易產(chǎn)生假陽(yáng)性突變。

石蠟作為組織包埋劑，其溫度設(shè)置對(duì)DNA質(zhì)量有不同程度的影響。一般盡量選擇低熔點(diǎn)蠟，且熔蠟的溫度設(shè)置為比熔點(diǎn)高2℃，可使固體石蠟全部液化即可。包埋用熔蠟的溫度應(yīng)<65℃，溫度太高，DNA發(fā)生部分解鏈，組織內(nèi)殘留的痕量甲醛可對(duì)解鏈后的DNA單鏈進(jìn)行甲基化修飾，修飾后的DNA單鏈在冷卻后不易復(fù)性而導(dǎo)致降解。

合適的蠟塊或切片存儲(chǔ)條件，將會(huì)減緩DNA降解的速度。常規(guī)的FFPE樣本一般保存在室溫下。有資料顯示，當(dāng)FFPE樣本儲(chǔ)存在4℃時(shí)，DNA降解程度較低^[6]。

圖3 不同儲(chǔ)存溫度下蠟塊DNA完整性的比較

（來(lái)源：Daniel, G. et al. | Plos One ）

注：組織樣本來(lái)源于大鼠。

2.1 脫蠟

由于石蠟可阻礙消化液對(duì)組織的滲透，從而抑制蛋白酶K與組織內(nèi)蛋白的接觸，影響組織消化和DNA釋放。所以在DNA提取過(guò)程中，脫蠟一定要徹底。

目前，二甲苯和環(huán)保脫蠟液都可用于FFPE樣本的脫蠟。用不同脫蠟液提取石蠟組織標(biāo)本DNA，發(fā)現(xiàn)兩者并無(wú)明顯差異^[7]。二甲苯是一種有毒的有機(jī)試劑，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中如果身體接觸到會(huì)有一定程度的危害，且二甲苯脫蠟過(guò)程繁瑣，實(shí)驗(yàn)過(guò)程涉及到的試劑種類較多，容易出錯(cuò)，故推薦一步法脫蠟。一步法脫蠟采用環(huán)保脫蠟液，使用安全，且脫蠟和裂解消化同步加熱進(jìn)行，在省去中間離心去上清步驟的同時(shí)，又可避免蠟殘余導(dǎo)致消化不完全。

圖4 不同脫蠟液提取FFPE DNA的純度、濃度檢測(cè)結(jié)果

（來(lái)源：何燕 et al. | 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志）

在消化過(guò)程中，消化時(shí)間與溫度也會(huì)影響DNA提取質(zhì)量。溫度過(guò)高不利于保護(hù)DNA，過(guò)低則不利于蛋白酶K消化。一般認(rèn)為蛋白酶K的最適工作溫度為56℃，而37℃則是大多數(shù)酶的最適反應(yīng)溫度。將37℃和56℃兩個(gè)溫度下蛋白酶K消化FFPE組織進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)56℃消化獲得的DNA量較多，且質(zhì)量較高^[8]。而消化時(shí)間從2小時(shí)到7天^[9]不等，一般認(rèn)為適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間有利于DNA的提取。具體消化時(shí)間可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求調(diào)整，以組織消化徹底，組織消化液清亮為準(zhǔn)，但是要保證在消化時(shí)間延長(zhǎng)過(guò)程中穩(wěn)定酶濃度，每延長(zhǎng)24h補(bǔ)加一次蛋白酶K，確保消化徹底。

2.3 其他因素

樣本提取過(guò)程中，為了提高DNA的洗脫效果，可將DNA洗脫液提前放置37℃預(yù)熱5min。

綜上，我們知道，對(duì)于FFPE DNA樣本來(lái)說(shuō)，無(wú)論是交聯(lián)、堿基轉(zhuǎn)換、堿基脫落抑或是DNA片段化，都是不可避免會(huì)發(fā)生的現(xiàn)象。為了減少DNA損傷影響，需要采取相應(yīng)的措施來(lái)降低假突變風(fēng)險(xiǎn)。

就組織樣本而言，取材結(jié)束后，就要對(duì)樣本進(jìn)行固定。固定一般采用10%中性福爾馬林固定液，樣本厚度建議不超過(guò)5mm，固定液與組織的比例至少應(yīng)為5:1，固定時(shí)間通常不超過(guò)48小時(shí)。包埋時(shí)，盡量選擇低熔點(diǎn)蠟，將包埋溫度設(shè)置成比熔點(diǎn)高2℃。此外，制備好的蠟塊或切片置于常溫保存，若條件允許的話，置于4℃保存，效果更佳。

在FFPE DNA提取過(guò)程中，脫蠟是否徹底是提取高質(zhì)量DNA的重要步驟。推薦使用一步法脫蠟。由于組織中DNA和蛋白質(zhì)相結(jié)合，若想釋放充分的DNA，則需56℃消化2h或過(guò)夜消化。同時(shí)，通過(guò)提前37℃預(yù)熱洗脫液5min，也可提高DNA得率。

參考資料：

1. Chen, L. , Liu, P. , Evans, T. C. , & Ettwiller, L. M. . (2017). dna damage is a pervasive cause of sequencing errors, directly confounding variant identification. Science, 355(6326), 752-756.

2. Do, H. , & Dobrovic, A. . (2015). Sequence artifacts in dna from formalin-fixed tissues: causes and strategies for minimization. Clinical Chemistry, 61(1), 64-71.

3. 吳凱. (2006). 甲醛與細(xì)胞內(nèi)DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)的關(guān)系. 國(guó)家環(huán)境與健康論壇.

4. Nagahashi, M. , Shimada, Y. , Ichikawa, H. , Nakagawa, S. , Sato, N. , & Kaneko, K. , et al. (2017). Formalin-fixed paraffin-embedded sample conditions for deep next generation sequencing. Journal of Surgical Research, 220(48), 125.

5. 石遠(yuǎn)凱, 孫燕, 于金明, 丁翠敏, 王子平, & 王長(zhǎng)利, et al. (0). 中國(guó)晚期原發(fā)性肺癌診治專家共識(shí)(2016年版). 中國(guó)肺癌雜志.

6. Daniel, G. , Christian, V. , Daniela, P. , Nadine, D. , Kurt, Z. , & Real, F. X. . (2018). Impact of storage conditions on the quality of nucleic acids in paraffin embedded tissues. PLOS ONE, 13(9).

7. 何燕, 王建東, 時(shí)姍姍, 章如松, 周曉軍, & 馬恒輝. (2013). 環(huán)保脫蠟液與二甲苯對(duì)石蠟包埋組織dna質(zhì)量影響的比較. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 29(2), 226-227.

8. 田子強(qiáng), 劉俊峰, 張少為, 李保慶, 王福順, & 張?jiān)路? (2004). 普通甲醛固定石蠟包埋組織dna提取方法的探討. 癌癥, 23(3).

9. Warford, A. , Pringle, J. H. , Hay, J. , Henderson, S. D. , & Lauder, I. . (1988). Southern blot analysis of dna extracted from formol–saline fixed and paraffin wax embedded tissue. Journal of Pathology, 154(4), 313.

以上，就是本期想與大家分享的“獲取高質(zhì)量DNA”的小技能，你get到了嗎？