MAQC協(xié)會(huì)緣起于2000年伊始，彼時(shí)微陣列基因芯片（Microarray）作為一種新興的技術(shù)逐漸成為基因組學(xué)的核心技術(shù)之一，但尚無相關(guān)質(zhì)控管理標(biāo)準(zhǔn)。為保證在監(jiān)管范圍內(nèi)的正確應(yīng)用，F(xiàn)DA MAQC協(xié)會(huì)于2005年便開啟了相關(guān)的質(zhì)控項(xiàng)目。

隨著技術(shù)的推進(jìn)，NGS技術(shù)近年開始成為腫瘤臨床實(shí)踐的常規(guī)手段。MAQC協(xié)會(huì)于2018年開始的第四階段（MAQC4）正是為了開發(fā)適用于NGS的標(biāo)準(zhǔn)分析協(xié)議和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，以增強(qiáng)科學(xué)研究和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)監(jiān)管，MAQC4也被稱為Sequencing Quality Control Phase 2，即SEQC2。

SEQC2多實(shí)驗(yàn)室、跨平臺(tái)性能驗(yàn)證考題介紹（液體活檢部分）

圖2. 實(shí)驗(yàn)流程設(shè)計(jì)邏輯示意圖（Figure 3a&b）

1. 實(shí)驗(yàn)樣本的準(zhǔn)備：為模擬真實(shí)世界的癌癥樣本和等位基因變異頻率（variant allele frequencies，VAF）范圍，研究人員利用10個(gè)已知癌癥細(xì)胞系的基因組信息在癌癥基因的外顯子區(qū)域內(nèi)構(gòu)建了一組約40000個(gè)“已知陽性突變位點(diǎn)”和約10.2 Mb的“已知陰性位點(diǎn)”的混合樣本，并基于此創(chuàng)建了不同VAF梯度的樣本，如VAF 0.1-0.5%、0.5-2.5%，>2.5%；對(duì)該樣本進(jìn)行了酶切后選擇大小約160-180bp的DNA片段模擬血液中ctDNA片段長(zhǎng)度；

2. 實(shí)驗(yàn)樣本發(fā)放給各家試劑盒生產(chǎn)商，并由生產(chǎn)商在美國(guó)、英國(guó)、中國(guó)和澳大利亞等地的13個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行單盲檢測(cè)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用5個(gè)液體活檢panel中的一個(gè)或者多個(gè)測(cè)序分析，分析結(jié)果則統(tǒng)一遞交至FDA進(jìn)行匯總，最終評(píng)估panel檢測(cè)靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性等臨床實(shí)踐核心指標(biāo)。

SEQC2考題已經(jīng)揭曉了“答案”，這些答案為臨床辨別優(yōu)秀的液體活檢檢測(cè)產(chǎn)品提供了方法指導(dǎo)，為大家整理如下：

ctDNA中包括大量低豐度基因變異，低豐度突變的準(zhǔn)確檢出一直是液體活檢臨床應(yīng)用的最大瓶頸，這也使得“panel測(cè)序深度是多少”成為臨床專家關(guān)注液體活檢技術(shù)時(shí)高頻提及的問題。但SEQC2項(xiàng)目的結(jié)果明確地告訴我們，當(dāng)建庫技術(shù)能力受限時(shí)，“測(cè)得深”不能帶來“測(cè)得準(zhǔn)”，只有當(dāng)建庫技術(shù)提升了靈敏度的天花板，測(cè)序深度才能帶來更準(zhǔn)確的結(jié)果。

在SEQC2項(xiàng)目呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)中，兩個(gè)參數(shù)揭示了不同建庫技術(shù)之間的能力差別，一是“有效片段回收率”，它體現(xiàn)了在同樣一管血中，經(jīng)過重重的信號(hào)采集和處理后，有多少有效的細(xì)胞游離DNA（cell free DNA，cfDNA）片段被保留下來用于分析，這一能力直接決定ctDNA檢出的可能性。

圖3 25ng投入量下有效片段回收率（Figure 3c）

二是“panel覆蓋均一性”，在同樣都是25ng的DNA投入量的情況下（相當(dāng)于7500個(gè)基因組拷貝），SEQC2比較了不同panel測(cè)序深度對(duì)目標(biāo)設(shè)計(jì)區(qū)域覆蓋率的差異，更好的覆蓋均一性可以保障即使困難區(qū)域也能得到良好的覆蓋，從而提升檢測(cè)的靈敏度。

圖4. 液體活檢panel覆蓋均一性評(píng)估（Figure S3a）

而在這兩個(gè)參數(shù)上，燃石朗清^?（圖中綠色BRP）都展現(xiàn)了最好的表現(xiàn)，這也解釋了為什么在原始測(cè)序深度并不突出的情況下，燃石朗清^?卻做到了最高之一的靈敏度。

在臨床實(shí)踐過程中，液體活檢panel的性能指標(biāo)中靈敏度和假陽性率（特異性）往往最受關(guān)注。高靈敏度的液體活檢是對(duì)低頻突變不漏檢的保障，同時(shí)低假陽性率則幫助患者抓住真正獲益的治療機(jī)會(huì)，避免了治療費(fèi)用和寶貴的治療時(shí)間窗口的浪費(fèi)，技術(shù)上的相互“制衡”似乎造成了靈敏度和假陽性率難兩全的局面。兼顧靈敏度和假陽性率也成為了檢測(cè)機(jī)構(gòu)保障液體活檢結(jié)果準(zhǔn)確性必須要攻克的難題。

SEQC2通過對(duì)每個(gè)文庫目標(biāo)區(qū)域已知變異的檢出結(jié)果分析，來評(píng)估基于雜交捕獲法的ctDNA檢測(cè)靈敏度。在高頻突變中，所有panel都表現(xiàn)出了極高的靈敏度，再次佐證了樣本中ctDNA含量對(duì)檢測(cè)結(jié)果的重要影響。但在VAF到達(dá)0.5%以下的“挑戰(zhàn)區(qū)”時(shí)，不同panel的表現(xiàn)開始呈現(xiàn)顯著的差異。其中，低VAF突變中燃石朗清^?（圖中綠色BRP）成為靈敏度最佳的NGS液體活檢panel之一：在VAF為0.3-0.5%時(shí)，靈敏度>90%。

圖5. 不同VAF對(duì)ctDNA檢測(cè)靈敏度的性能評(píng)估（Figure 4a）

而在保證高靈敏度的同時(shí)，如何保持低假陽性率，來確保結(jié)果的準(zhǔn)確性？參與SEQC2的所有panel分析均使用獨(dú)特的分子標(biāo)識(shí)符（Unique Molecular Identifiers，UMIs）來糾正測(cè)序錯(cuò)誤，假陽性率相對(duì)較低?？紤]panel大小后，在25 ng DNA投入量下，燃石朗清^?的假陽性率最低（0.03 FP/kb），錯(cuò)誤的變異幾乎完全發(fā)生在VAF<0.5%的區(qū)域。綜合靈敏度與特異性的整體評(píng)估，NGS液體活檢panel中燃石朗清^?準(zhǔn)確性最佳。

圖6. 25ng DNA投入量時(shí)，不同panel 假陽性率表現(xiàn)(Supplementary Table 5)

圖7. 25ng DNA投入量時(shí)，燃石朗清^?（圖中綠色BRP）的準(zhǔn)確性最佳（Figure 4b）

“中心實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果，在同樣的測(cè)序平臺(tái)、實(shí)驗(yàn)方法和分析方法下，可以在院內(nèi)實(shí)驗(yàn)室復(fù)現(xiàn)嗎？”這可能是臨床醫(yī)生和院內(nèi)檢測(cè)科室都會(huì)關(guān)注的問題。

SEQC2評(píng)估了同樣的樣本在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)室間的檢測(cè)結(jié)果可重復(fù)性，數(shù)據(jù)顯示，同一panel在同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不同批次之間和不同實(shí)驗(yàn)室不同批次之間的可重復(fù)性是相似的。這意味著這些參與SEQC2研究的NGS panel試劑盒的檢測(cè)性能和生信分析具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，結(jié)果的波動(dòng)性來自隨機(jī)而非系統(tǒng)性的室間差異。

圖8. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果可重復(fù)性評(píng)估（Figure 4c&4d）

同時(shí)，所有panel都在中高頻變異（VAF 0.5-2.5%、VAF>2.5%）中呈現(xiàn)了較高的可重復(fù)性，但在低頻變異（VAF 0.1-0.5%）的可重復(fù)性有所下降，這也提示了臨床實(shí)踐中ctDNA 低頻變異為液體活檢帶來的挑戰(zhàn)。綜合所有實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)室間的差異性評(píng)估，燃石朗清^?（圖中綠色BRP）的分析性能可重復(fù)性同樣表現(xiàn)最佳。

在NGS的真實(shí)應(yīng)用場(chǎng)景里，患者血液樣本中提取的cfDNA含量通常很少，尤其是當(dāng)液體活檢應(yīng)用于早期腫瘤患者時(shí)。燃石醫(yī)學(xué)內(nèi)部數(shù)據(jù)顯示，從一管外周血（8-10ml）中，約15-20%的腫瘤患者提取到的cfDNA總量不足25ng，因此，低投入量情況下液體活檢的技術(shù)能力也值得格外關(guān)注。

SEQC2考題中，測(cè)量了高（50 ng）、中（25 ng）和低（10 ng）DNA投入量時(shí)每個(gè)雜交捕獲panel分析的性能。在最低10 ng DNA投入量時(shí)，燃石朗清^?的靈敏度可重復(fù)性均表現(xiàn)最佳，這確保了在真實(shí)臨床場(chǎng)景的應(yīng)用中對(duì)“困難樣本”檢測(cè)能力的穩(wěn)定表現(xiàn)。

圖9. 不同DNA投入量時(shí)對(duì)panel性能的綜合考量（Figure 5）

NGS技術(shù)的誕生使得腫瘤患者一次檢測(cè)所有靶向用藥的機(jī)會(huì)成為可能，而液體活檢技術(shù)的發(fā)展則拓寬了腫瘤NGS應(yīng)用的場(chǎng)景和人群范圍，將可以從精準(zhǔn)醫(yī)療中獲益的患者從晚期逐步推進(jìn)到早期，同時(shí)可以幫助醫(yī)生進(jìn)行患者治療的全程管理。但液體活檢質(zhì)量的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)對(duì)醫(yī)生和患者來說，仿佛一直是一種看不見、摸不著的東西。

SEQC2項(xiàng)目首次通過單盲的評(píng)估實(shí)驗(yàn)，提供了一個(gè)直觀、客觀、全面、且定量地感受技術(shù)高低的機(jī)會(huì)，從而給出標(biāo)準(zhǔn)和依據(jù)幫助醫(yī)生判斷什么是高質(zhì)量的液體活檢產(chǎn)品，以及目前液體活檢的技術(shù)邊界在哪里。

燃石朗清^?在SEQC2液體活檢項(xiàng)目中呈現(xiàn)了傲人的性能，這凝聚了燃石醫(yī)學(xué)在技術(shù)研發(fā)與質(zhì)量管理上多年的耕耘和堅(jiān)持，我們?yōu)橹罡凶院?，也期待這樣的成績(jī)?yōu)橹袊?guó)NGS行業(yè)建立更多的信心和信念。燃石醫(yī)學(xué)將始終攜手臨床專家、協(xié)會(huì)和管理機(jī)構(gòu)，堅(jiān)定地推動(dòng)NGS行業(yè)在中國(guó)的規(guī)范化進(jìn)程，最終能夠獲益腫瘤患者。