試劑盒介紹：

呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus, RSV）屬于副黏病毒科的肺病毒屬（Pneumovirus），主要引起6個月以下嬰兒患細支氣管炎和肺炎等下呼吸道感染，以及較大兒童和成人的鼻炎、感冒等上呼吸道感染。其發(fā)生機制除病毒感染直接作用外，可能與嬰幼兒呼吸道組織學特性、免疫功能發(fā)育未完善及免疫病理損傷有關(guān)。嚴重RSV疾病免疫病理損傷主要是機體產(chǎn)生特異性IgE抗體與RSV相互作用引起Ⅰ型超敏反應(yīng)。

本試劑盒適用于體外定量檢測人血清、血漿，細胞培養(yǎng)液或其它相關(guān)生物液體中呼吸道合胞病毒F蛋白含量。

試劑盒基本原理：

本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫定量法檢測human RSV-F蛋白含量，酶標板采用納米共價包被Human RSV F蛋白捕捉抗體，檢測時酶標板孔加入待檢樣品或標準品，再加入F蛋白檢測抗體（生物素化抗RSV F蛋白抗體）,反應(yīng)后加入鏈霉親和素HRP，最后加入單組份TMB底物液顯色;如果待檢樣品中含有RSV-F蛋白，TMB底物液在HRP催化下顯色，加入終止液終止顯色后，在酶標儀OD450/OD630讀取吸光值，在合適濃度范圍內(nèi)，吸光值大小與待檢測樣品中RSV-F蛋白濃度呈正相關(guān)，根據(jù)標準品濃度/吸光值繪制的標準曲線，可計算出待檢樣品中F蛋白含量。

實驗所需自備物品:

1.酶標儀(帶有450nm和630nm波長濾光片)

2.高精度移液器，EP管及一次性吸頭：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL

3.37℃恒溫箱，雙蒸水或去離子水

4.吸水紙

待檢測樣品的收集方法:  

1.血清：全血樣品于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，收集血液的試管應(yīng)為一次性的無熱原，無內(nèi)毒素試管。

2.血漿：抗凝劑推薦使用EDTA-Na2，樣品采集后30分鐘內(nèi)于1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測。避免使用溶血，高血脂樣品。

3.組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。

4.細胞培養(yǎng)上清：取細胞培養(yǎng)上清于1000×g離心20分鐘，除去雜質(zhì)及細胞碎片。取上清檢測。

5.其它生物樣品：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測。

6.樣品應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。

7.樣品收集后若在1周內(nèi)進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃(1個月內(nèi)檢測)，或-80℃（6個月內(nèi)檢測），避免反復(fù)凍融。

8.如果您的樣品中檢測物濃度高于標準品最高值，請根據(jù)實際情況，做適當倍數(shù)稀釋（建議先做預(yù)實驗，以確定稀釋倍數(shù)）。

檢測前準備工作:

1.請?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，將各組分平衡至室溫。

2.洗滌液配制：將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶，屬于正?，F(xiàn)象，可用40℃水浴微加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超過50℃，使用時洗滌液應(yīng)為室溫），當日現(xiàn)配現(xiàn)用 。

3.標準品配制:瓶身標注有標準品含量 ：標準品為凍干品，使用前用PBS或者去離子水復(fù)溶到0.5ml（此時標準品濃度為C0）,然后根據(jù)需要,取適量標準品用通用稀釋液 進行1：2倍比稀釋（注：不要直接在反應(yīng)孔中進行倍比稀釋）。建議配制成以下濃度：C0、C0/2、C0/4、C0/8、C0/16、C0/32、C0/64，樣品稀釋液直接作為空白孔0。

例如：標準品管標注為25ng,加水0.5ml復(fù)溶，此時C0=50ng/ml, 用通用稀釋液 進行1：2倍比稀釋最為標準品的濃度依次為50ng/ml,25 ng/ml，12.5 ng/ml，6.25 ng/ml，3.13 ng/ml，1.56 ng/ml，0.78 ng/ml，0 ng/ml（稀釋液作為空白對照）

4. 檢測抗體工作液：實驗前計算當次實驗所需用量（以100μL/孔計），檢測抗體（100×）用通用稀釋液稀釋100倍，實際配制時應(yīng)多配制100-200μL；

5.鏈霉親和素HRP工作液：實驗前計算當次實驗所需用量（以100μL/孔計），鏈霉親和素HRP（100×）用通用稀釋液稀釋100倍 ，實際配制時應(yīng)多配制100-200μL；

6.TMB底物液:使用前，提前放置室溫平衡。