行業(yè)動態(tài) | 抗體偶聯(lián)藥（ADC）開發(fā)的一般流程和關(guān)鍵考量因素mp.weixin.qq.com/s/YO-vQs8x3D-aB5oYeTAmOw

內(nèi)容概要

化療（Chemotherapy）是一種傳統(tǒng)的癌癥治療方法，也是迄今為止最為有效且使用最廣泛的方法。然而，由于化療藥物或療法通常無靶向特性，所以在殺死癌細胞的同時也可能攻擊正常組織和細胞，從而導(dǎo)致骨髓抑制、胃腸毒性、免疫抑制、內(nèi)臟損傷、神經(jīng)毒性等副作用。

抗體-藥物偶聯(lián)藥（Antibody drug conjugates，ADCs）可以為抗癌藥物安裝上精確的“導(dǎo)航系統(tǒng)”，從而有效解決上述問題。ADC是將單克隆抗體藥物（Monoclonal antibodies, mAbs）的高特異性和小分子化學(xué)藥物的強細胞毒性相結(jié)合的藥物，用以提高腫瘤藥物的靶向性、減少毒副作用。一般而言，ADC藥物由抗體（Antibody或mAb）、連接子（Linker）、細胞毒性藥物（Cytotoxin，或稱有效荷載（Payload））三個部分組成：通過mAb將藥物輸送至目標(biāo)腫瘤細胞，使ACD獲得高度的靶向性；Linker負責(zé)連接抗體和細胞毒性有效荷載；Payload負責(zé)殺傷腫瘤細胞。因此，ADC能夠區(qū)分健康組織和病變組織，故能夠在對健康細胞影響較小的前提下發(fā)揮最大療效。本文簡單介紹了ADC藥物的結(jié)構(gòu)特征、作用機制、開發(fā)方法、表征技術(shù)及監(jiān)管策略。

知識要點

1、何謂ADC？基本結(jié)構(gòu)及作用機理；2、ADC如何偶聯(lián)？偶聯(lián)方法及Linker的選擇；3、ADC抗原和抗體如何選？目標(biāo)抗原和抗體的選擇方法；4、ADC如何表征？ADC開發(fā)中常用的檢測方法；5、ADC藥物如何監(jiān)管？介紹不同監(jiān)管部門的要求和職責(zé)。

簡介

在過去的幾十年中，癌癥的藥物和療法得到了快速發(fā)展，放療、化療、基于小分子或單抗的靶向藥物等治療技術(shù)得到廣泛應(yīng)用。其中，傳統(tǒng)的化療藥物一般通過通過抑制微管功能、DNA合成、抑制翻譯后蛋白質(zhì)合成等各種機制作用于癌細胞，抑制腫瘤細胞分裂、增殖或存活。然而，化療的非靶向細胞毒性可能會引起嚴重的不良反應(yīng)。

近年來，越來越多的人類癌細胞表面特異性抗原被發(fā)現(xiàn)，使得通過通過mAb靶向性治療癌癥方法成為可能。然而，由于mAb的分子尺寸較大，所以其主要缺點是會增加非預(yù)期的免疫原性反應(yīng)風(fēng)險。而且，由于其大尺寸和親水性特征，一般難以穿透癌細胞的細胞膜，故其治療效果較差。為了克服這些問題，可以引入了抗體介導(dǎo)的靶向遞送技術(shù)或重組工程技術(shù)來克服這些問題，從而增強抗體的療效。將Cytotoxin與mAb通過化學(xué)反應(yīng)偶聯(lián)起來，便可以針對特定疾病進行靶向給藥，即所謂ADC藥物。除了賦予化學(xué)藥（Cytotoxin/Payload）靶向特性以外，mAb和Payload也可能產(chǎn)生協(xié)同的治療作用。除了Payload自身的細胞毒性外，mAb也可通過以下三種主要機制特異性地性結(jié)合表面抗原并殺死腫瘤細胞：（a）通過阻斷生長因子及其受體信號傳導(dǎo)途徑而誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡；（b）通過補體依賴性細胞毒性（Complement dependent cytotoxicity，CDC）調(diào)節(jié)T細胞功能，補體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性（complement dependent cellular cytotoxicity, CDCC）或抗體依賴性細胞毒性（Antibody dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC）；（c）對腫瘤血管系統(tǒng)和基質(zhì)細胞的抑制作用。

典型的ADC包括三個組成部分：mAb、Payload和Payload（圖 2）。該技術(shù)提高了藥物靶向癌細胞的能力，且可以有效改善高細胞毒性藥物的靶向遞送效率，擴大治療窗口。

本文將全面總結(jié)ADC的開發(fā)過程和表征技術(shù)，以及其在技術(shù)和監(jiān)管層面的挑戰(zhàn)。

主要論述

何謂ADC?

ADC的結(jié)構(gòu)

ADC包含單克隆抗體（mAbs）和細胞毒性劑（Cytotoxin，有效載荷（Payload）），二者以化學(xué)連接物（連接子，Linker）共價結(jié)合而形成ADC，其一般結(jié)構(gòu)如圖 2所示。

具體而言，在ADC的研究和開發(fā)中，人源化或全人單克隆抗體（Human monoclonal antibodies，hmAbs）是首選的藥物遞送介質(zhì)，其可確保高度的細胞靶點特異性、長循環(huán)半衰期和低免疫原性。由于mAb對腫瘤特異性抗原具有高度的結(jié)合特異性，可以作為對腫瘤細胞有殺傷作用的有效載荷的載體。而且，人類腫瘤細胞中會過量表達一些獨特的特異性抗原，一些mAbs可以識別和結(jié)合這些抗原，并誘導(dǎo)針對靶癌細胞的免疫反應(yīng)，所以其本身也可作為單一藥物用于癌癥治療。然而，由于mAbs導(dǎo)致細胞死亡的程度不同，所以其療效往往受限，有時甚至可能無效。但是，將放射性同位素或細胞毒性藥物（Payload）裝載至mAbs上后便能克服抗體治療效率不足的問題。

ADC的作用機理

在設(shè)計ADC藥物之前，需要仔細了解各組成部分在體內(nèi)的作用機理（圖 2）。理想的ADC應(yīng)保持mAbs的特異性和靶向性，且能夠有效地釋放Payload以破壞腫瘤細胞。通常，靜脈途徑可防止胃酸條件、蛋白酶和肽酶等蛋白水解酶降解ADC中的mAb，所以更加適合ADC藥物遞送。而且，ADC中的mAb組分在血液中循環(huán)的存留時間更長，從而可以增強其與靶癌細胞中的特異性抗原的結(jié)合能力。

當(dāng)ADC分子進入血液后，其中的mAb組分可以特異性地識別并結(jié)合靶癌細胞中高度表達的細胞表面抗原，形成ADC抗原復(fù)合物（Ag-Ab complex）。然后，復(fù)合物通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用內(nèi)化至細胞中。其中，網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞起關(guān)鍵作用，最終復(fù)合物在其作用下形成初級內(nèi)體。酸化的氫離子可以流入初級內(nèi)體，從而能進一步加速ADC中的mAb與人類新生兒Fc受體（FcRns）之間的相互作用。該過程通過緩沖機制起作用，由于生理pH值7.4不適于ADC與細胞的結(jié)合過程，故可防止ADC錯誤地遞送至正常的健康細胞。內(nèi)體的表達主要受FcRn控制，未結(jié)合的FcRn受體直接形成內(nèi)體，隨后經(jīng)溶酶體降解。結(jié)合ADC的內(nèi)體也會在溶酶體內(nèi)進行處理，進而在胞內(nèi)釋放生物活性形式的細胞毒性Payload（通常為抗有絲分裂劑）。釋放的Payload可通過破壞胞內(nèi)的DNA鏈或微管、抑制拓撲異構(gòu)酶或RNA聚合酶、切割目的蛋白或者誘導(dǎo)凋亡等方式導(dǎo)致細胞死亡。因此，通常使用對癌細胞具有高效力而對正常細胞毒性較低的細胞毒性化學(xué)制劑作為Payload。此外，由于ADC中mAb與Payload通過Linker以化學(xué)共價鍵偶聯(lián)在一起，Linker雖小，但其也是ADC中很重要的組成部分，可以保證ADC在循環(huán)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和良好的藥代動力學(xué)特性，并能在腫瘤部位高效釋放Payload，且Linker本身也應(yīng)具有一定的穩(wěn)定性。

簡而言之，可將ADC視為抗腫瘤細胞毒性藥物的精密遞送系統(tǒng)。ADC在從血管運輸至腫瘤組織中的靶分子的過程中會暴露在不同的條件下，故其細胞或分子水平上的作用模式較為復(fù)雜，每一步都具有一定的挑戰(zhàn)性：

1、血液循環(huán)：ADC在血漿中循環(huán)時必須表現(xiàn)得像裸抗體一樣。而且，Linker必須在血液中保持穩(wěn)定，以避免其損害健康組織，而且能夠通過高效分解或降解反應(yīng)釋放Payload，進而將后者運送至目標(biāo)部位。

2、抗原結(jié)合：偶聯(lián)的mAb必須保持較高的免疫親和力。因此，將細胞毒性化合物連接至mAb后不得影響其結(jié)合特異性。為了避免干擾mAb的抗原識別作用，偶聯(lián)位點應(yīng)盡量避開mAb中與抗原結(jié)合的Fc或恒定區(qū)。

3、內(nèi)化：必須達到足夠的細胞內(nèi)藥物濃度。這通常較難，因為細胞表面的抗原靶點數(shù)量有限，故抗原-抗體復(fù)合物的內(nèi)化效率一般較低。

4、藥物釋放：一旦內(nèi)化后，ADC必須在腫瘤細胞內(nèi)以其活性形式有效釋放Payload。為了讓Payload在釋放后能夠重新獲得全部的細胞毒性能力，需開發(fā)可在靶點位置釋放完整而無修飾形式的Payload的Linker。通常，Linker可能會影響Payload結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，因此必須在血漿穩(wěn)定性和在靶細胞中高效釋放藥物的能力之間尋找合適的平衡點。

5、細胞毒性作用：即使是在低濃度下，釋放后的Payload的效力也必須足以殺死腫瘤細胞。為了獲得足夠的細胞毒性，必須使用IC50為亞納摩爾級別的非常有效的藥物。以細胞毒性物質(zhì)作為獨立的化療劑進行試驗時發(fā)現(xiàn)，ADC中Payload的候選物須為高毒性化合物，其細胞毒性為傳統(tǒng)抗癌藥物的100到1000倍。

此外，由于“3”和“4”的原因，通常需要將幾種藥物結(jié)合起來，而且還需要適當(dāng)優(yōu)化Payload的用量，以實現(xiàn)所需療效。然而，如果抗體上附著了太多的細胞毒性分子，其可能會被機體識別為受損蛋白而被迅速清除。此外，采用多種藥物可能會影響藥代動力學(xué)，因此大多數(shù)情況下每個抗體會偶聯(lián)2-4種藥物以提供最佳的治療窗口。

ADC如何偶聯(lián)？

針對不同的病變細胞選擇理想的靶向mAb和Payload是至關(guān)重要的，且Linker和偶聯(lián)策略也是非常關(guān)鍵的開發(fā)內(nèi)容。Linker以共價鍵偶聯(lián)負責(zé)免疫應(yīng)答的mAb和Payload，其分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)是ADC藥代動力學(xué)、藥效動力學(xué)和充足治療窗口的基本決定因素。理想的ADC必須滿足以下幾個標(biāo)準(zhǔn)：

1、在Linker血漿中必須具有足夠的穩(wěn)定性，以保證ADC可以在循環(huán)系統(tǒng)中正常運輸，而不會過早裂解，從而將Payload限制在腫瘤部位。如果過早釋放，會使有細胞毒性的Payload損傷非靶細胞，引發(fā)不良反應(yīng)。因此，有必要根據(jù)不同的抗原、腫瘤和Payload類型確定合適的Linker，并合理優(yōu)化以提高其穩(wěn)定性。

2、一旦ADC進入靶腫瘤細胞，Linker必須具備快速釋放完整無修飾Payload的能力。

3、選擇Linker時需考慮的另一個特性是疏水性。疏水性Linker與疏水性Payload的結(jié)合經(jīng)常會促進ADC復(fù)合物的積累。

目前，已根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)開發(fā)了一些Linker和偶聯(lián)技術(shù)。其中，最常用的兩種偶聯(lián)技術(shù)為化學(xué)偶聯(lián)法和酶偶聯(lián)法，可以根據(jù)Payload的釋放機制將連接子結(jié)構(gòu)分為可裂解連接子（Cleavable linker）和非可裂解連接子（Non-cleavable linker）兩大類。

偶聯(lián)方法

化學(xué)偶聯(lián)法

在化學(xué)偶聯(lián)中，通過可控化學(xué)反應(yīng)將mAb表面上的可用氨基酸殘基與Linker上引入的反應(yīng)柄連接起來，一般需要根據(jù)所選的偶聯(lián)策略優(yōu)化mAb與Payload的比例（Drug antibody ratios，DARs）和結(jié)合位點。

賴氨酸-酰胺偶聯(lián)策略

賴氨酸-酰胺偶聯(lián)策略是一種非常有效的ADC偶聯(lián)策略，其利用含羧酸酯的Linker將Payload與mAb中自由的賴氨酸殘基連接在一起。常見的mAb分子上含有約80個賴氨酸殘基，其中約有10個可用于化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)。通常，通過這種方式會產(chǎn)生多種具有不同DAR和偶聯(lián)位點的ADC分子。然而，DAR會影響ADC的PK/PD和細胞毒性，其中有幾個對Ag-Ab相互作用不利的賴氨酸殘基，在偶聯(lián)后可能會發(fā)生改變。此外，雖然FDA已經(jīng)批準(zhǔn)了幾種基于賴氨酸的ADC，但通過該偶聯(lián)策略所得ADC的結(jié)合親和力較低。因此，在賴氨酸-酰胺偶聯(lián)中需要控制合適的DAR和合理優(yōu)化偶聯(lián)方式，以開發(fā)符合需求的ADC分子。

半胱氨酸偶聯(lián)策略

半胱氨酸偶聯(lián)策略是基于mAb的半胱氨酸殘基與Payload上引入的硫代反應(yīng)官能團之間的反應(yīng)將二者結(jié)合起來。通常，mAb中所有半胱氨酸殘基均形成二硫鍵，因此無游離巰基。人類ADC中最常用的mAb是IgG1，含有4個鏈間和12個鏈內(nèi)二硫鍵。其中，一般僅4個鏈間二硫鍵能在可控條件下被選擇性地還原。因此，由于巰基的數(shù)量有限，所以通過這種方式偶聯(lián)的位點較少，所涉及的反應(yīng)較明確。相較于賴氨酸-酰胺偶聯(lián)策略，半胱氨酸偶聯(lián)策略在異質(zhì)性和DAR的控制方面表現(xiàn)更佳，所產(chǎn)生的ADC更高效，且治療窗口更寬。

此外，將活性鈀膦絡(luò)合物與芳基鹵化物混合而制成芳基鈀試劑，能快速有選擇性地與抗體的還原半胱氨酸殘基發(fā)生巰基芳基化反應(yīng)，從而可有效控制DAR。運用該方法所得芳基半胱氨酸偶聯(lián)物的穩(wěn)定性更高，對外部添加的硫醇、氧化劑、堿和酸的敏感度更低。

非天然氨基酸偶聯(lián)策略

無論上述傳統(tǒng)偶聯(lián)策略的可控性如何，皆無法直接使用，仍需要進行大量的優(yōu)化。通過引入乙酰苯丙氨酸等非天然氨基酸殘基可以根據(jù)需求對特定位點進行化學(xué)偶聯(lián)，從而能夠更加高效地控制DAR。不過，該策略也存在一個缺點，非天然氨基酸可能會誘發(fā)不良免疫反應(yīng)。

酶學(xué)偶聯(lián)法

與化學(xué)偶聯(lián)法一樣，各種酶也被用于偶聯(lián)細胞毒性Payload與mAb，其可選擇性地修飾抗體中的結(jié)合氨基酸序列和對應(yīng)的功能基團。運用該方法可以實現(xiàn)特異性位點偶聯(lián)，從而能更有效地控制DAR。

轉(zhuǎn)肽酶偶聯(lián)策略

轉(zhuǎn)肽酶/分選酶（Sortase）是從金黃色葡萄球菌中分離出來的一種酶，可用于轉(zhuǎn)肽反應(yīng)介導(dǎo)的偶聯(lián)。Sortase能特異性地識別蛋白中的LPXTG（X：任何氨基酸）序列，專一性地切割蘇氨酸-甘氨酸（T-G）結(jié)合位點，形成?；?底物復(fù)合物，N端帶有多聚甘氨酸的親核基團進攻復(fù)合物，最終形成偶聯(lián)產(chǎn)物。運用該方法可通過化學(xué)計量學(xué)方法控制特異性偶聯(lián)位點和DAR，且不會對抗體與相應(yīng)抗原的結(jié)合作用產(chǎn)生不利影響。

微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶偶聯(lián)策略

微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（Microbial transglutaminase，MTGase）亦可催化轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，其主要催化蛋白質(zhì)或多肽中谷氨酰胺上的酰胺與其它伯胺之間的?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，參與蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)或小分子之間交聯(lián)形成異肽鍵。因此，TGase可以將Payload與脫糖mAb中特定谷氨酰胺（Q295）進行共價偶聯(lián)而形成ADC。

基于氮葡聚糖工程技術(shù)的偶聯(lián)策略

此外，還可采用基于β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（β-1,4-galactosyltransferase，GalT）和α-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶（α-2,6-sialyltransferase，SialT）的氮葡聚糖（N-Glycan）工程技術(shù)進行偶聯(lián)。

在體外，可利用半乳糖基和唾液酸轉(zhuǎn)移酶的酶促反應(yīng)引入末端唾液酸。這些唾液酸可經(jīng)高碘酸鹽氧化產(chǎn)生醛基，并進一步通過肟鍵與Payload共價偶聯(lián)。

該技術(shù)的主要優(yōu)點在于：無論N-Glycan的異質(zhì)性如何，該策略皆具有較高的可重復(fù)性，因此可用于含各種N-Glycan的任何mAb與Payload的偶聯(lián)。

鏈接子如何選？

連接子（Linker）在ADC結(jié)果中起著至關(guān)重要的作用，其會影響ADC的藥代動力學(xué)參數(shù)、治療指數(shù)和藥效。Linker可維持ADC復(fù)合物在血流中的穩(wěn)定性，并最大限度地減少非靶向效應(yīng)。而且，在腫瘤細胞內(nèi)化ADC的過程中，Linker應(yīng)能夠快速釋放細胞毒性藥物。此外，DAR是ADC開發(fā)中一個非常關(guān)鍵的參數(shù)，因此非常有必要通過結(jié)合位點的優(yōu)化解決藥效、穩(wěn)定性和藥代動力學(xué)參數(shù)相關(guān)問題，常見ADC的DAR接近4。可根據(jù)可裂解性質(zhì)對Linker進行分類，即可裂解Linker和非可裂解Linker。

可裂解Linker

可裂解Linker可進一步分為三種類型：腙、二硫化物和肽Linker。在腫瘤特異性細胞內(nèi)環(huán)境中，每種Linker表現(xiàn)不同：分別為低pH敏感性、谷胱甘肽敏感性和蛋白酶敏感性。

酸敏感性腙Linker在癌細胞內(nèi)體和溶酶體的低pH（4-6）下容易發(fā)生酸水解，這有利于有效釋放Payload。

二硫鍵Linker在血液循環(huán)中具有良好的穩(wěn)定性，它們利用癌細胞內(nèi)較高濃度的谷胱甘肽進行釋放。癌細胞富含谷胱甘肽，這與腫瘤細胞生長和缺氧所導(dǎo)致的高度應(yīng)激狀態(tài)相關(guān)。

另一種形式的可裂解Linker是溶酶體蛋白酶敏感肽，例如：組織蛋白酶B可作用于在腫瘤細胞內(nèi)切割A(yù)DC的二肽鍵的腫瘤特異性蛋白酶；纈氨酸瓜氨酸是一種組織蛋白酶B敏感型二肽；β-葡萄糖醛酸酶是一種在許多腫瘤中過量表達的酶，β-葡萄糖醛酸對該酶較敏感，可被其降解和水解，故可將β-葡萄糖醛酸作為蛋白酶敏感的Linker用于選擇性地釋放Payload。

非可裂解Linker

非可裂解Linker包括不可降解的硫醚或馬來酰亞胺己?；∕aleimidocaproyl，MC），其在ADC中Payload內(nèi)化至靶癌細胞后經(jīng)溶酶體酶降解。例如，Kadcyla是FDA批準(zhǔn)的ADC，其中maytansinoid毒素通過不可降解MC Linker與mAb連接。

Linker和偶聯(lián)技術(shù)仍在持續(xù)快速發(fā)展，各種新的高效Linker不斷涌現(xiàn)。例如： Syntarga是由SpaceLink Technology和Syntagra BV開發(fā)的一種高度靈活的基于Linker的ADC，其Linker與Payload可逆偶聯(lián)。

合理選擇和優(yōu)化Linker及其與Payload的偶聯(lián)策略可有效提高ADC的治療效果和減少脫靶效應(yīng)。

ADC抗原和抗體如何選？

目標(biāo)抗原如何選？

靶抗原的選擇是ADC開發(fā)成功的主要因素，理想的靶點應(yīng)具備以下特點：

1、靶點是腫瘤細胞特異性的，不會出現(xiàn)于健康組織細胞；

2、抗原應(yīng)在配體存在下通過內(nèi)吞作用內(nèi)化，并應(yīng)可再循環(huán)至質(zhì)膜；

3、腫瘤微環(huán)境中抗原表達均勻，但循環(huán)系統(tǒng)中抗原的可及率低。

因此，ADC應(yīng)具有靶向特異性，且副作用最小。僅在癌細胞中表達，而不會在正常健康細胞中表達。尤其在實體瘤治療中，腫瘤體積大且具有一定的異質(zhì)性，此為腫瘤治療中最大的挑戰(zhàn)。因此，需要對抗原進行優(yōu)化，以增強腫瘤細胞抗原對特定靶點的內(nèi)化作用。

一般而言，內(nèi)化效率取決于靶細胞類型、抗體性質(zhì)和抗原表位特征。無論配體如何，大部分抗原都分布在細胞外表面，少有抗原會被內(nèi)化。不過，抗原內(nèi)化作用并非誘導(dǎo)治療效果所必需的條件。這是因為，二硫鍵連接的ADC會在實體腫瘤部位的內(nèi)皮下細胞外基質(zhì)上被還原，從而可增加腫瘤血管附近Payload的積累，使藥物擴散至腫瘤組織塊中。此外，靶向腫瘤抗原的另一個挑戰(zhàn)是物理和動力學(xué)屏障，即：與抗原異質(zhì)性表達和間質(zhì)腫瘤細內(nèi)高壓力相關(guān)的旁側(cè)效應(yīng)（Bystander effect）。旁側(cè)效應(yīng)使得Payload從腫瘤細胞內(nèi)部擴散至鄰近健康細胞，從而對其產(chǎn)生不良影響。

抗體如何選？

抗體的選擇是ADC開發(fā)中的另一個重要步驟，理想的抗體應(yīng)具備五大特征：

1、高抗原親和力；

2、靶向特異性；

3、在循環(huán)系統(tǒng)中的保留時間足夠長；

4、盡可能避免免疫原性反應(yīng)；

5、盡可能防止免疫交叉反應(yīng)。

具體而言，理想的抗體應(yīng)具有0.1-1 nM范圍內(nèi)的結(jié)合親和力。第一代ADC中一般使用小鼠抗體，但其會引起嚴重的免疫原性反應(yīng)。為了克服這個問題，通過生物工程學(xué)研究開發(fā)了各種嵌合、人源化、完全人類抗體等。目前，在ADC的開發(fā)過程中主要使用人源化或完全人類抗體。在人源化抗體中，要么將小鼠互補決定區(qū)（Complementarity determining regions，CDR）重新表面化，要么直接移植至人Fv表面。臨床試驗中，大多數(shù)ADC由人類免疫球蛋白G（IgG）組成，尤其是IgG1。

ADC如何表征？

ADC復(fù)合物由mAb、Linker和Payload三部分組成，故其分子性質(zhì)較為復(fù)雜，需要采用多種分析方法進行表征。

一般需要采用基于分離的技術(shù)表征ADC的單體含量、游離藥物和載藥能力，例如：尺寸排阻色譜法（Size-exclusion chromatography，SEC）、反相色譜法（Reversed-phase chromatography，RPC）、疏水相互作用色譜法（Hydrophobic interaction chromatography，HIC）等。此外，質(zhì)譜（Mass Spectroscopy，MS）可用于識別細微的分子結(jié)構(gòu)變化；SEC可用于對揮發(fā)性流動相中的ADC進行脫鹽；在穩(wěn)定性研究期間還可采用SEC檢測ADC片段；運用電噴霧電離質(zhì)譜（Electrospray Ionisation Mass Spectrometry，ESI-MS）技術(shù)可識別基于半胱氨酸偶聯(lián)技術(shù)的ADC的載藥分布，其優(yōu)點在于可更準(zhǔn)確地觀察分子離子或準(zhǔn)分子離子；通過液質(zhì)聯(lián)用（Liquid Chromatography Coupled Mass Spectroscopy，LCMS）與RPC相結(jié)合的方法可確認偶聯(lián)類型和DAR。通常，LCMS技術(shù)用于Fc結(jié)構(gòu)域中含有保守N-低聚糖的還原或非還原性ADC的分析，以減少異質(zhì)性。

RPC和HIC為基于分子疏水性的分離方法。其中，RPC用于確定藥物負荷、藥物分布和異質(zhì)性，量化分析ADC混合物中的游離藥物、ADC在不同儲存條件下的穩(wěn)定性以及表征通過重鏈或輕鏈附著到藥物L(fēng)inker上的mAb。與RPC類似，HIC是另一種用于表征ADC疏水性的分析技術(shù)，DAR較高的ADC表現(xiàn)出高疏水性，可通過HIC進行表征。

此外，親水性相互作用色譜（Hydrophilic interaction chromatography，HILIC）是一種比反相液相色譜更有效的亞單位水平免疫結(jié)合物表征技術(shù)，運用LC-MS與HILIC相結(jié)合的方法可表征ADC的Payload和聚糖修飾；肽圖分析法（Peptide mapping）是研究特定ADC荷藥分布的另一種工具，多用于研究蛋白質(zhì)分子的一級結(jié)構(gòu)和確定蛋白質(zhì)分子內(nèi)表面暴露的表位；酶法通常用于去除Fc結(jié)構(gòu)域中的保守N-低聚糖；生物分析測定法用于評估釋放的游離藥物、抗體總量和DAR；ELISA是定量與mAbs相偶聯(lián)的Payload的經(jīng)典方法；MS用于測定游離藥物的濃度；基于特定配體的分析方法用于了解ADC的特異性結(jié)構(gòu)，可作為早期篩選技術(shù)；電化學(xué)發(fā)光技術(shù)已用于表征完整ADC分子的結(jié)合能力。

ADC如何監(jiān)管？

根據(jù)美國食品和藥物管理局（Food And Drug Administration，F(xiàn)DA）要求，ADC藥物需根據(jù)生物許可證申請（Biological License Applications，BLA）流程進行審批。

通常，mAb在生物制劑評價和研究中心（Center for Biologics Evaluation and Research，CBER）進行評估，ADC在FDA藥物評價和研究中心（Center for Drug Evaluation and Research，CDER）進行評估。自2003年以來，二者均在CDER進行評估和審查。實際上，在ADC的申請審批過程中，需要對mAb、Linker和Payload三種主要原液（Drug substances，DSs）進行質(zhì)量表征，所有相關(guān)的信息和數(shù)據(jù)均需要在申請文件中的化學(xué)、制造和控制（Chemistry, Manufacturing, and Control，CMC）部分呈現(xiàn)。FDA的審查過程主要由生物制品辦公室（Office of Biological Products，OBP）和新藥質(zhì)量評估辦公室（Office of New Drug Quality Assessment，ONDQA）執(zhí)行，OBP負責(zé)審查和監(jiān)管mAb及細胞庫相關(guān)的生產(chǎn)流程，ONDQA負責(zé)審查和監(jiān)管Payload和Linker等小分子組分相關(guān)的生產(chǎn)流程（圖 10）。

ONDQA對ADC的監(jiān)管要求

根據(jù)ONDQA的要求，若所產(chǎn)材料是最終的DS，則需對Payload和Linker進行表征，表征指標(biāo)包括：旋光性、手性、分子多態(tài)性、雜質(zhì)（產(chǎn)品相關(guān)、工藝相關(guān)、游離藥物及其相關(guān)物質(zhì)、殘留溶劑、重金屬）等、生物活性（靶向特異性結(jié)合作用、結(jié)合親和力、效應(yīng)功能）以及藥物效力。

通常認為，Linker和細胞毒性藥物Payload為起始材料，Linker與Payload（Liner-Payload）的組合為中間體，ADC為最終DS。一般還需表征各種起始原材料的來源，包括：Linker和Payload的來源；微生物等發(fā)酵相關(guān)原材料的來源；對天然產(chǎn)物、肽和化學(xué)合成化合物進行結(jié)構(gòu)修飾時所產(chǎn)生的半合成化合物等。而且，還必須表征所有起始材料相關(guān)的雜質(zhì)，并開發(fā)可控的流程去除或減少雜質(zhì)。此外，還需運用紫外光譜、紅外光譜、核磁共振光譜、質(zhì)譜和元素分析法等多種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來表征Linker、Payload和Linker-Payload偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)。

如上所述，為了確定產(chǎn)品中的雜質(zhì)，必須通過穩(wěn)定性相關(guān)數(shù)據(jù)驗證相應(yīng)的純度分析方法，并且對Linker與Payload偶聯(lián)過程中可能產(chǎn)生的雜質(zhì)進行分析。必須開發(fā)減少或去除雜質(zhì)的工藝，并通過已驗證的方法確定最終產(chǎn)品中的雜質(zhì)殘留。對于ADC的三種組分中的任意一種組分，含量高于0.1%均需進行結(jié)構(gòu)表征。

OBP對ADC的監(jiān)管要求

從OBP監(jiān)管的角度，若mAb是最終的DS，mAb中間物與ADC的表征、質(zhì)量控制和臨床前和臨床材料表現(xiàn)評估方面的監(jiān)管要求均相同。因此，mAb的表征包括一級結(jié)構(gòu)（氨基酸組成、N端/C端序列分析、肽圖譜）、構(gòu)象結(jié)構(gòu)（分子大小和電荷異質(zhì)體、分子量）、翻譯后修飾（唾液酸水平、單糖含量和寡糖分布）等方面的分析和評估，以確定是否存在片段、聚集體和電荷異質(zhì)體，考察其對目標(biāo)抗原的親和力和特異性。mAb應(yīng)具有效應(yīng)功能，且能與Fcγ受體（FcgR）和新生兒Fc受體（FcRn）結(jié)合。另外，還應(yīng)評估m(xù)Ab中間體在靶細胞中對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響；若一些mAb本身具有細胞毒性活性，也需進行相應(yīng)的評估。據(jù)此，需開發(fā)表征方法來分析分析mAb的效應(yīng)功能，若抗體亞型為IgG4則還需開發(fā)減少半抗的策略。

雜質(zhì)方面，必須分析確定和表征mAb生產(chǎn)過程中的產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)（二聚體、多集體、降解物等）和工藝相關(guān)雜質(zhì)（微生物污染物、宿主細胞蛋白（Host cell proteins，HCPs）、宿主細胞DNA等）相關(guān)雜質(zhì)。其中，分子大小異質(zhì)體和電荷異質(zhì)體是常見的產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)。若存在雜質(zhì)，則需對雜質(zhì)的生物活性進行表征，并了解其對ADC在機體內(nèi)活性的潛在影響。與mAb最終產(chǎn)品一樣，需開發(fā)可專一性分析、鑒定和量化mAb工藝相關(guān)雜質(zhì)的方法，并對其進行充分的驗證。此外，還須開發(fā)病毒清除和宿主細胞量化方法。而且，需根據(jù)人體可能接受的最大劑量進行雜質(zhì)評估，并且對工藝相關(guān)雜質(zhì)的去除方法進行充分的驗證。

ONDQA 與OBP的職責(zé)

在一名評審員的領(lǐng)導(dǎo)下，OBP和ONDQA共同評審ADC的原液（Drug substances，DSs）和成品（Drug products，DPs），具體審查內(nèi)容如下：

ONDQA

從ONDQA角度，對ADC的DS進行審計中的考慮因素包括：結(jié)構(gòu)識別和表征、雜質(zhì)分析和污染控制。其中，藥物分布（Drug distribution，或載藥量（Loading））和DAR是ADC結(jié)構(gòu)表征中非常重要的指標(biāo)。DAR指的是與mAb結(jié)合的Payload的平均數(shù)量，其為ADC的一個重要屬性。DAR值影響藥物的療效，載藥量過低會降低效力，而載藥量過高則會對藥代動力學(xué)和細胞毒性產(chǎn)生不利影響。藥物分布表示ADC中每個mAb結(jié)合數(shù)的分布情況，藥物分布不同的ADC可能具有不同的藥理學(xué)和毒理學(xué)特征。

Linker-Payload中間體是通過多步化學(xué)反應(yīng)所得的產(chǎn)物，故必須確定其生產(chǎn)過程中的雜質(zhì)及其形成機制和驗證方法，據(jù)此確定DS中是否存在藥物相關(guān)物質(zhì)、游離毒素、殘留溶劑和其它工藝相關(guān)雜質(zhì)（催化劑、金屬），并進行量化和制定詳細的相關(guān)規(guī)范。

在開始一期臨床試驗和創(chuàng)新性藥品（Investigational New Drug，IND）申報之前，應(yīng)在臨床前毒理學(xué)研究階段對藥物相關(guān)雜質(zhì)進行鑒定。而且，必須通過上述方法證明臨床前（IND-enabling）毒理學(xué)研究所用批次與臨床材料之間的DAR和藥物分布特征具有可比性。

FDA建議，在關(guān)鍵臨床試驗（三期臨床）之前，必須對Linker-Payload中間體的雜質(zhì)特征進行表征，且需對含量>0.1%的單個雜質(zhì)進行結(jié)構(gòu)鑒定。OBP和ONDQA一起審查ADC數(shù)據(jù)文件，主要關(guān)注點為ADC的純度（游離藥物、游離抗體）和效力（DAR、載藥量分布）。

OBP

OBP主要關(guān)注ADC中的mAb組分，根據(jù)OBP指南，必須對mAb結(jié)構(gòu)進行表征。肽圖譜是用于表征mAb中間體一級序列的技術(shù)，采用該方法比較游離mAb，以確定結(jié)合位點。同時，也采用該方法分析ADC的批間一致性。ADC中間體中的mAb組分還有的其它一些關(guān)鍵參數(shù)，包括：電荷、分子大小、糖基化、抗原結(jié)合和其它生物學(xué)活性。 偶聯(lián)工藝對這些參數(shù)具有重要作用，故必須謹慎評估和描述這些屬性。根據(jù)Linker的基本化學(xué)性質(zhì)，可基于電荷和分子大小分離ADC。例如：采用半胱氨酸偶聯(lián)法不會改變mAb的電荷異質(zhì)性。

還需要運用針對游離mAb的純度分析方法來表征ADC組分，例如：SEC-HPLC、SDS-PAGE/CGE和電荷異質(zhì)性分析方法等。若mAb發(fā)生任何變化，必須進行相應(yīng)的可比性研究。而且，還需對分析方法進行充分驗證，以評估不同的臨床和商業(yè)化（若已上市）批次所產(chǎn)樣品的毒理學(xué)性質(zhì)。盡管一般主要關(guān)注Linker-Payload部分的變化，但也必須對游離mAb與結(jié)合Linker-Payload的mAb進行比較，據(jù)此評估載藥量的變化。

小編總結(jié)：在過去的幾年中，ADC的結(jié)構(gòu)優(yōu)化、方法開發(fā)和作用機制研究方面取得了很大的進展，有望克服傳統(tǒng)抗體藥物的不足，發(fā)掘抗體藥物的新應(yīng)用方向，通過ADC技術(shù)提高抗體相關(guān)藥物的療效。因此，本文討論了ADC的基本概念、結(jié)構(gòu)特征、作用機制以及開發(fā)ADC藥物的各種偶聯(lián)/連接技術(shù)和監(jiān)管策略。

目前，對傳統(tǒng)化療藥物的耐藥機制和非特異性靶向作用的了解仍相當(dāng)有限，但通過ADC的特異性靶向作用可以有效規(guī)避這些問題，故ADC在抗癌治療方面具有巨大的潛力。不過，ADC包括Payload、Linker和mAb三個組成部分，這使得其結(jié)構(gòu)較傳統(tǒng)抗體更為復(fù)雜，從而增加了分子開發(fā)的難度。

因此，ADC的開發(fā)中存在一些挑戰(zhàn)。首先，非預(yù)期細胞毒性問題有待解決。與傳統(tǒng)化療藥物相比，盡管ADC大大提高了靶向效率，但僅少量的ADC會聚集至腫瘤中。其危險性在于，Payload的毒性通常是常規(guī)化療藥物的成百上千倍，而Linker在正常細胞中不一定絕對穩(wěn)定，若在正常組織中非特異性地釋放Payload，則可能導(dǎo)致系統(tǒng)性不良反應(yīng)和降低最大耐受劑量（Maximum tolerated dose，MTD），這極大地限制了ADC的治療潛力。未來，可以設(shè)計更多更多選擇性更強的Linker，既可在腫瘤組織中快速釋放Payload，又能有效降低藥物對正常組織的非靶向毒性。而且，ADC也可能導(dǎo)致耐藥性。ADC產(chǎn)生耐藥性的詳細機制尚未確定，可能的原因包括：靶抗原下調(diào)、ADC內(nèi)化減少、Payload外流等。另外，ADC中通常使用全長mAb，實體瘤滲透受限和內(nèi)吞效率受限的問題在所難免。一方面，可以使用更小的納米抗體來提高效率；另一方面，也可采用具有細胞外釋放能力的Linker來突破這些限制。最后，Linker的結(jié)構(gòu)相對較復(fù)雜，這給臨床前研究和臨床應(yīng)用帶來了困難。因此，開發(fā)結(jié)構(gòu)簡單、功能完整的Linker可能是未來一個重要的研究方向。

綜上所述，ADC的開發(fā)過程涉及的知識面較廣，為了開發(fā)更為理想和有效的ADC分子，不僅需要對傳統(tǒng)抗體的特性和生產(chǎn)過程有深刻的了解，還需要了解其潛在的生物化學(xué)、免疫學(xué)、藥理作用和分子方面的知識，據(jù)此選擇合適的靶抗原、mAb、Paylaod、Linker和偶聯(lián)技術(shù)，并進行合理優(yōu)化，以克服各種穩(wěn)定性問題和藥效問題和應(yīng)對未來各種復(fù)雜的癌癥。相信在不久的將來，隨著抗體技術(shù)、連接器技術(shù)和新型有效載荷的持續(xù)發(fā)展，終將開發(fā)出具有更加精準(zhǔn)的靶向性和更強大的腫瘤細胞毒性功效的理想ADC，以促進腫瘤治療技術(shù)的發(fā)展。

參考資料

1. Chari, Ravi VJ, Michael L Miller and Wayne C Widdison. "Antibody–Drug Conjugates: An Emerging Concept in Cancer Therapy." Angewandte Chemie International Edition 53, no. 15 (2014): 3796-3827.

2. Dennler, Patrick, Aristeidis Chiotellis, Eliane Fischer, Delphine Brégeon, Christian Belmant, Laurent Gauthier, Florence Lhospice, Fran?ois Romagne and Roger Schibli. "Transglutaminase-Based Chemo-Enzymatic Conjugation Approach Yields Homogeneous Antibody-Drug Conjugates." Bioconjugate chemistry 25, no. 3 (2014): 569-578.

3. DeVita, Vincent T and Edward Chu. "A History of Cancer Chemotherapy." Cancer research 68, no. 21 (2008): 8643-8653.

4. Ducry, Laurent and Bernhard Stump. "Antibody? Drug Conjugates: Linking Cytotoxic Payloads to Monoclonal Antibodies." Bioconjugate chemistry 21, no. 1 (2010): 5-13.

5. Kommineni, Nagavendra, Palpandi Pandi, Naveen Chella, Abraham J. Domb and Wahid Khan. "Antibody Drug Conjugates: Development, Characterization, and Regulatory Considerations." Polymers for Advanced Technologies 31, no. 6 (2020): 1177-1193.

6. Mo, Ran and Zhen Gu. "Tumor Microenvironment and Intracellular Signal-Activated Nanomaterials for Anticancer Drug Delivery." Materials Today 19, no. 5 (2016): 274-283.

7. Shen, Ben-Quan, Keyang Xu, Luna Liu, Helga Raab, Sunil Bhakta, Margaret Kenrick, Kathryn L Parsons-Reponte, Janet Tien, Shang-Fan Yu and Elaine Mai. "Conjugation Site Modulates the in Vivo Stability and Therapeutic Activity of Antibody-Drug Conjugates." Nature biotechnology 30, no. 2 (2012): 184-189.

8. Su, Zheng, Dian Xiao, Fei Xie, Lianqi Liu, Yanming Wang, Shiyong Fan, Xinbo Zhou and Song Li. "Antibody?Drug Conjugates: Recent Advances in Linker Chemistry." Acta Pharmaceutica Sinica B, (2021).

9. Tsuchikama, Kyoji and Zhiqiang An. "Antibody-Drug Conjugates: Recent Advances in Conjugation and Linker Chemistries." Protein & cell 9, no. 1 (2018): 33-46.

10. Zhou, Qun, James E Stefano, Charlene Manning, Josephine Kyazike, Bo Chen, Diego A Gianolio, Anna Park, Michelle Busch, Julie Bird and Xiaoyang Zheng. "Site-Specific Antibody-Drug Conjugation through Glycoengineering." Bioconjugate chemistry 25, no. 3 (2014): 510-520.

11. Zhu, Xiaoyu, Shihan Huo, Chao Xue, Bo An and Jun Qu. "Current Lc-Ms-Based Strategies for Characterization and Quantification of Antibody-Drug Conjugates." Journal of Pharmaceutical Analysis 10, no. 3 (2020): 209-220.

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