2022年2月15日 開發(fā)出大腦神經(jīng)活動可視化的新型小鼠系統(tǒng)——利用高靈敏度高速鈣傳感器成功測量神經(jīng)活動—— 概要 為了弄清復(fù)雜的大腦功能，從活動物的大腦中正確測量各個神經(jīng)細胞活動的技術(shù)是必不可少的。 由京都大學(xué)研究生院生命科學(xué)研究科坂本雅行特定副教授、東京大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)系研究科井上昌俊特任助教(研究當(dāng)時:斯坦福大學(xué)博士研究員)、東京大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)系研究科尾藤晴彥教授等組成的聯(lián)合研究小組，成功開發(fā)出了穩(wěn)定表達高靈敏度高速鈣傳感器的基因修飾小鼠。 近年來，作為使神經(jīng)活動可視化的方法，廣泛使用了使用熒光燈傳感器的神經(jīng)活動成像法。 在本研究中，為了實現(xiàn)更正確的神經(jīng)活動測量，開發(fā)了高靈敏度高速鈣傳感器( G-CaMP9a )，并制作了能夠誘導(dǎo)細胞種類特異性表達該新傳感器的基因修飾小鼠( G-CaMP9a基因敲入小鼠注1 )。 通過使用雙光子激發(fā)顯微鏡注2的生物成像觀察神經(jīng)細胞的活動，結(jié)果表明該小鼠能夠更準確地檢測神經(jīng)細胞對感覺刺激的響應(yīng)。 制備的小鼠鈣傳感器表達水平穩(wěn)定均勻，有望成為闡明復(fù)雜高級腦功能的有用資源。 本成果將于2022年2月14日(當(dāng)?shù)貢r間)在線發(fā)表在美國國際學(xué)術(shù)雜志《Cell Reports Methods》上。

1 .背景 在我們的大腦中，數(shù)百~千億個神經(jīng)細胞(神經(jīng)元)形成了巨大的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，通過進行復(fù)雜的信息處理，實現(xiàn)了認知和學(xué)習(xí)等各種高級大腦功能。 高級腦功能的結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜且費解，可以說是有望闡明的現(xiàn)代科學(xué)的終極課題之一。 為了理解高級腦功能的機制，需要正確測量各個神經(jīng)細胞的活動。 為了測量這個神經(jīng)細胞的活動，近年來，應(yīng)用鈣離子隨著神經(jīng)發(fā)火注3流入細胞內(nèi)的熒光鈣傳感器的成像技術(shù)得到了迅速的發(fā)展。 另外，通過使用雙光子激發(fā)顯微鏡，也可以從活動物的大腦中記錄神經(jīng)細胞的活動。 但是，以往的鈣傳感器只檢測神經(jīng)活動的有無及其強度，為了正確測量神經(jīng)起火的頻率及其次數(shù)，時間分辨率不夠。 為了實現(xiàn)準確的活動測量，希望開發(fā)出反應(yīng)速度快、神經(jīng)起火次數(shù)與傳感器的熒光變化量之間呈線性關(guān)系的鈣傳感器。 另外，作為將鈣傳感器導(dǎo)入神經(jīng)細胞的方法，經(jīng)常使用腺病毒注4。 然而，在使用病毒的導(dǎo)入法中，列舉了鈣傳感器的表達水平因細胞而異和細胞毒性等問題。 為了解決這個問題，需要建立一個沒有細胞毒性、能夠穩(wěn)定表達和誘導(dǎo)鈣傳感器的小鼠系統(tǒng)。 2 .研究方法成果 傳統(tǒng)的鈣傳感器大部分使用肌肉來源蛋白質(zhì)鈣結(jié)合序列( M13 )作為鈣模塊( CaM )注5結(jié)合區(qū)。 本研究用鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶( CaMKK )的CaM結(jié)合區(qū)取代了綠色鈣傳感器G-CaMP4.1肌肉來源蛋白的鈣結(jié)合序列。 在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)CaMKK對鈣離子和CaM的復(fù)合體具有高親和性。 結(jié)果，與現(xiàn)有的綠色鈣傳感器相比靈敏度高，且表示鈣離子濃度和熒光強度的變化的關(guān)系的Hill系數(shù)注6為1.6 (現(xiàn)有的傳感器為2以上)，成功創(chuàng)造出線性度非常高的鈣傳感器( G-CaMP9a )。接下來，進行了在小鼠基因組Rosa26基因座注7中導(dǎo)入G-CaMP9a的基因修飾小鼠( G-CaMP9a基因敲入小鼠)的制作及其評價。 制作的基因敲入小鼠使用Flp/FRT系統(tǒng)注8，設(shè)計為能夠僅在目標組織和細胞種類中表達誘導(dǎo)G-CaMP9a。 關(guān)于G-CaMP9a基因敲入小鼠的評價，我們使用了采用雙光子激發(fā)顯微鏡的生物成像技術(shù)進行。 結(jié)果表明，在小鼠大腦皮質(zhì)初級視覺區(qū)和軀體感覺區(qū)，興奮性神經(jīng)細胞對自發(fā)點燃和感覺刺激的應(yīng)答可以在1個細胞水平上檢測到。 研究還表明，抑制性神經(jīng)細胞亞型之一的生長抑素陽性神經(jīng)細胞中，部分細胞群在活動模式上具有非常高的同步性。 并且，通過在G-CaMP9a基因敲入小鼠中導(dǎo)入紅色鈣傳感器XCaMPR，成功地實現(xiàn)了可以同時測量興奮性神經(jīng)細胞和抑制性神經(jīng)細胞活動的多色成像。3 .波及效果，今后的安排 本研究成果表明，能穩(wěn)定表達誘導(dǎo)高靈敏度高速鈣傳感器的基因修飾小鼠是闡明復(fù)雜高級腦功能的有用資源。 期待通過使用開發(fā)出的老鼠，可以得到新的知識，了解大腦在學(xué)習(xí)和記憶過程中是如何工作的。 另外，通過在開發(fā)的小鼠中應(yīng)用光遺傳學(xué)注9工具，也可以同時進行全光學(xué)( All-optical )神經(jīng)活動測量和操作。 希望將來通過應(yīng)用于疾病模型動物的神經(jīng)活動測量，也能對精神疾病和高級腦功能障礙的治療方法開發(fā)有所幫助。 由于鈣離子在所有細胞種類中發(fā)揮重要作用，因此本研究開發(fā)的基因修飾小鼠不僅局限于神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域，還有望應(yīng)用于新藥品的開發(fā)等各種生命科學(xué)領(lǐng)域。 4 .關(guān)于研究項目 本研究是科學(xué)技術(shù)振興機構(gòu)( JST )戰(zhàn)略性創(chuàng)造研究推進事業(yè)的先驅(qū)研究領(lǐng)域“利用創(chuàng)新性光科學(xué)技術(shù)創(chuàng)造最先進科學(xué)”中的研究課題“闡明應(yīng)用計算機全息術(shù)的動作電位發(fā)生機構(gòu)”( JPMJPR1906 )、 在日本醫(yī)療研究開發(fā)機構(gòu)( AMED )大腦和心靈的研究推進計劃“基于創(chuàng)新技術(shù)的大腦功能網(wǎng)絡(luò)的全貌闡明項目(創(chuàng)新大腦)”中的研究開發(fā)課題“基于活動痕跡的復(fù)用標識和全光學(xué)檢索的電路功能闡明技術(shù)開發(fā)”( JP19dm0207079 )、 文部科學(xué)省新學(xué)術(shù)領(lǐng)域研究“記憶情緒下多領(lǐng)域大腦信息動態(tài)的光學(xué)測量與控制”( JP17H06312 )、科學(xué)研究費補助金( JP21K19429、JP20H04122、 JP18K19493、JP16H06728、JP15K18372、JP19H01007、JP16H06276 )的支持下取得的成果。<用語解說> 注1基因敲入小鼠: 通過基因操作，向目標基因組區(qū)域?qū)胪庠椿虻男∈蟆?注2雙光子激發(fā)顯微鏡: 雙光子吸收過程激發(fā)分子并觀察其熒光的顯微鏡。 即使是傳統(tǒng)成像技術(shù)難以實現(xiàn)的生物深部熒光分子，也可以無創(chuàng)地進行觀察。 注3神經(jīng)起火: 神經(jīng)細胞膜電位應(yīng)達到活動電位。 通過點火從上游神經(jīng)細胞向下游神經(jīng)細胞傳遞信息。 注4腺病毒: 用于將外源基因?qū)爰毎牟《尽?非致病性，近年來不僅用于基礎(chǔ)研究，還用于基因治療的臨床開發(fā)。 注5鈣調(diào)蛋白( CaM ) 鈣結(jié)合蛋白。 檢測細胞中鈣離子濃度，向鈣敏感酶等蛋白質(zhì)傳遞信號。 注6 Hill系數(shù): 顯示鈣離子和傳感器熒光強度變化協(xié)同性的指標。 Hill系數(shù)大于1協(xié)同性越高，熒光強度對鈣離子呈正協(xié)同性，呈非線性變化。 注7 Rosa26基因座: 存在于小鼠第六染色體上的基因組區(qū)域。 插入的基因幾乎不受其他基因的影響，穩(wěn)定表達。 在所有細胞種類中均有表達，因此被用作外源基因的導(dǎo)入位點。 注8 Flp/FRT系統(tǒng): 來源于出芽酵母的重組酶Flp對由被稱為FRT序列的34個堿基構(gòu)成的DNA序列進行作用而產(chǎn)生的位點特異性重組反應(yīng)。 通過在靶基因序列前后設(shè)計FRT序列，可不可逆地去除Flp作用所夾的區(qū)域。 注9光遺傳學(xué): 由光激活的蛋白質(zhì)在細胞中表達，通過光操作其功能的技術(shù)。 光照可以無創(chuàng)地誘導(dǎo)神經(jīng)細胞活動電位。 <研究者的評論> 在眾多共同研究者的老師的幫助下，成功開發(fā)了這次的基因修飾小鼠。 今后也將以進一步闡明大腦功能為目標，向?qū)嵱霉ぞ叩拈_發(fā)邁進(坂本)。<論文標題和作者> 標題a FLP-dependent g-camp9a transgenic mouse for neuronal imaging in vivo (使用FLP依賴性GCaMP9a轉(zhuǎn)基因小鼠的生物神經(jīng)活動成像) 作者Masayuki Sakamoto，Masatoshi Inoue，Atsuya Takeuchi，Shigetaka Kobari，Tatsushi Yokoyama，Shin-ichiro Horigane，sayaka take Masanobu Kano，Kazuo Kitamura，Hajime Fujii，Haruhiko Bito 刊登雜志Cell Reports Methods DOI 10.1016/j.cmeth.2022.100168  <聯(lián)系方式> 坂本雅行 京都大學(xué)研究生院生命科學(xué)研究科特定副教授 TEL:075-751-4032 e-mail:Sakamoto.MAS ayuki.2e [ at ] Kyoto-u.AC.jp 尾藤晴彥 東京大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)系研究科教授 tel:03-5841-3559傳真: 03-3814-8154 e-mail:hbi to [ at ] m.u-Tokyo.AC.jp <新聞采訪相關(guān)咨詢方式> 京都大學(xué)總務(wù)部宣傳科國際宣傳室 tel:075-753-5729傳真: 075-753-2094 e-mail:comms [ at ] mail2.ADM.Kyoto-u.AC.jp 東京大學(xué)醫(yī)學(xué)部醫(yī)學(xué)系研究科總務(wù)小組 tel:03-5841-3304傳真: 03-5841-8585 e-mail:ishomu [ at ] m.u-Tokyo.AC.jp 科學(xué)技術(shù)振興機構(gòu)宣傳科 tel:03-5214-8404傳真: 03-5214-8432 電子郵件: jst koho [ at ] jst.go.jp <關(guān)于JST事業(yè)的咨詢方式> 科技振興機構(gòu)戰(zhàn)略研究推進部綠色創(chuàng)新集團 嶋林裕子 tel:03-3512-3526傳真: 03-3222-2066 電子郵件: presto [ at ] jst.go.jp < AMED聯(lián)系方式> 日本醫(yī)療研究開發(fā)機構(gòu)疾病基礎(chǔ)研究事業(yè)部疾病基礎(chǔ)研究科 大腦和心靈健康促進計劃 基于創(chuàng)新技術(shù)的腦功能網(wǎng)絡(luò)全容闡明項目 TEL:03-6870-2286 電子郵件: brain-m [ at ] amed.go.jp