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【4】Hplc緩沖液選擇 ：反相色譜中如何選擇緩沖液 ：2010-9-29 http://www./dvbbs/dispbbs.asp?boardid=176&ID=211792&replyID=211792 化合物的劃分 HPLC分離的樣品從其在分離體系內(nèi)（或者說是流動相下）的狀態(tài)來劃分，可以分為中性樣品和離子型樣品。所謂中性樣品就是在分離條件下不能解離的化合物，而離子型化合物則能夠解離出離子。換句話說，離子型樣品是指酸堿鹽類的化合物，而中性化合物是除此之外的化合物。 有鹽流動相好在那里 反相色譜（RPC）分離樣品主要基于待分離化合物的極性實現(xiàn)分離的。在其他條件相類似的情況（分子量、空間結(jié)構(gòu)）下極性強的物質(zhì)保留值小。對于中性樣品來說其極性取決于化合物本身，但是對于離子型化合物可以通過調(diào)整其是否解離或者解離程度來調(diào)整其極性，最終達(dá)到調(diào)整其保留值、分離度和拄效（一般保留值提前會帶來拄效的提高）。 在分離含有少數(shù)化合物待檢樣品的情況下，使用無鹽流動相是一般是可行的（可以不考慮其是否全部或者部分未中性化合物）。因為分離的化合物少，可能分離度方面的要求相對不是很重要，而保留值的調(diào)整還可以采用調(diào)整流動相的洗脫能力、流速等條件得以實現(xiàn)。但是對于分離多組分的樣品采用無鹽流動相往往就會遇到麻煩。此時需要嘗試采用有鹽流動相，也就是要用到緩沖液。當(dāng)然如果樣品中的化合物全部都是中性化合物采用有鹽流動相也是很難奏效的，可是這樣的時候畢竟比較少。所以，在分離多組分待檢樣品時如果無鹽緩沖液效果不好，要首先考慮有鹽流動相。 緩沖液 緩沖液是能夠提供共軛酸堿對，在一定條件下穩(wěn)定pH值的一種溶液。使用緩沖液就可以控制分離過程中的p H，進而控制化合物的解離程度，達(dá)到調(diào)整化合物極性的目的。 緩沖液控制pH的能力就是緩沖液的緩沖容量。其大小由三方面因素決定，分別是：所要控制的pH、緩沖鹽的pKa和緩沖鹽的濃度。這里就涉及你要控制的pH和選用的緩沖鹽的關(guān)系，好在這方面的數(shù)據(jù)一般的色譜書中都會有提及，查一查就可以解決問題。關(guān)于緩沖鹽濃度認(rèn)為采用30mM是比較好的，這是一個通常的參數(shù)，一般來講進樣量越少、分子量越大、酸堿官能團越少選用的鹽濃度可以越小。緩沖鹽濃度越小對儀器和色譜拄越好。 緩沖液的選擇 對于已知化合物來說這個比較容易。如果是一個堿性化合物，在無鹽流動相下保留時間過長，那么可以采用控制流動相為低pH條件，使其達(dá)到完全解離，增加其極性，達(dá)到縮短分離時間的目的。如果分離的化合物pKa比較低（酸性化合物），在無鹽流動相下保留時間比較長，可以采用控制流動相為高一些的pH條件，道理相同。對于保留時間過短的采用相反的調(diào)整方式即可，不贅述。 對于分離多個組分而且未知化合物組成的樣品就顯得比較麻煩了。缺少相關(guān)分離樣品的資料只能從實驗入手了。也就是說嘗試各種pH值的流動相（期間最好有機相的比例固定），一般來說從低pH試起是一個比較好的選擇，因為我做過的化合物多是堿性化合物（這點僅當(dāng)參考），再有常用ODS柱子適用pH范圍相對第一些。 另外，在調(diào)試分離最佳的pH條件的時候，可以采用一種鹽——枸櫞酸鹽，其有點是在Ph2.1～6.4之間等體積混合相同濃度不同pH的緩沖液，混合后的pH值幾乎是兩者的平均值。聲明這一點我沒有試驗過，從書上看來的。如果這樣，在有雙通道儀器上調(diào)整流動相的pH值將會非常方便。確定好了pH值，然后在換成常用的緩沖鹽就OK了。 上面說的是pH范圍的選擇。在確定了分離最適合的pH之后，就是確定用那種緩沖鹽了。一般從兩個方面考慮，一是溶解度，要求在所用的有機相比例下易溶解，否則容易造成系統(tǒng)內(nèi)緩沖鹽析出；二是要考慮截至波長的問題。磷酸鹽是比較常用的，可以有兩個緩沖范圍2.0~3.0和6.2～8.2，截至波長小于200nm。注意：緩沖鹽中的雜質(zhì)可能嚴(yán)重影響其截至波長。碳酸鹽也不錯，但是在低pH會有CO2放出，可能導(dǎo)致緩沖效果降低。 緩沖液的制備 流動相的pH就指的是流動相中緩沖液的pH值。不要把有機相混入緩沖液之后再調(diào)其pH。 流動相或者緩沖液過濾的問題。有人傾向于先過濾緩沖液然后混合有機相使用。也有的是有機相與緩沖液混合之后統(tǒng)一過濾。雖然各有缺點，但我認(rèn)為第二種做法更好些。因為畢竟這樣做最儀器和柱子更為保險些，雖然有可能在抽了過程中有可能引起部分溶劑揮發(fā)，但我認(rèn)為可以忽略之。 緩沖液不易長時間放置，尤其是夏天，會生細(xì)菌。2天內(nèi)使用比較合適。 系統(tǒng)沖洗 用緩沖液的系統(tǒng)用過后一定、務(wù)必要沖洗。用過渡流動相是一種好辦法。過渡流動相就是分析用流動相中去掉無機鹽。但是有機相比例較少的最好不要用過渡流動相沖洗。 結(jié)束語 采用有鹽流動相是反相色譜普中常用的方法，尤其適合分離離子型化合物。只是也有其缺點就是儀器維護上稍微費事點。這種方法不能解決分離中的所有問題，有些復(fù)雜樣品必須借助于梯度洗脫或者離子對色譜。 【3】乙酸-乙酸鈉緩沖液配制 1E)實驗要求用PH6.0-6.4乙酸-乙酸鈉，現(xiàn)配出來的用酸度計測出PH是5.42，怎么將調(diào)至PH6.0-6.4,當(dāng)然是增加乙酸鈉，減少乙酸啦 【】 |
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