5分鐘講清楚怎樣把微生物多樣性的數(shù)據(jù)用到文章里

桔梗下的小金魚 2022-03-05

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無論是16S、18S、還是ITS，都是最常用的菌群多樣性分析的手段。對于新手，如果收到一份不講“情面”的16S測序結果析報告，很快就會被各種生態(tài)學術語、各種指數(shù)、各種分析方法弄得暈頭轉(zhuǎn)向。滿心喜悅完成實驗拿到了結果，如何有效運用這些結果發(fā)高分SCI呢？今天小編帶大家一起來梳理16S測序報告，迅速理清重點關注對象。

1. 擴增子測序流程

首先我們要對測序過程有個基礎的了解，下圖為擴增子測序流程，結題報告包括下圖的序列聚類與數(shù)據(jù)分析兩部分。后續(xù)所有的數(shù)據(jù)分析都是基于OTU表進行的，這張表中包括我們測的所有序列中，有多少類型序列（OTU聚類或ASV降噪），然后將聚類完的類型序列與物種數(shù)據(jù)庫比對，得到我們測的所有序列中有哪些物種，每個物種有多少，即豐度的概念。

圖：擴增子測序流程

2. 文章常用分析內(nèi)容

下圖是16s測序的分析內(nèi)容，展現(xiàn)了主要的分析內(nèi)容，每個主要分析內(nèi)容下有更細致的分析內(nèi)容，這些小的分析內(nèi)容，其實是可有選擇的使用，例如物種組成分析中有物種組成柱狀圖、分類等級樹圖、GraPhlAn進化樹圖、Krona物種組成圖，這幾個分析的內(nèi)容都是在解決樣本中有哪些細菌，細菌的相對豐度是多少。一般文章中常用的是物種組成柱狀圖。有的老師會認為，文章中要包含所有的分析內(nèi)容，其實不然，我們只需要結合自己的研究預期目的選擇合適的分析內(nèi)容即可，并不是多多益善。下面我們就按照SCI文章的要求和寫作結構順序，一一跟大家介紹重點分析內(nèi)容。

3. 測序結果描述

1. 文章在材料方法描述完以后進入結果部分，首先我們要交代一下這次測序的情況。例如我們測得的原始數(shù)據(jù)有多少，質(zhì)控后的有效數(shù)據(jù)有多少，每個樣本質(zhì)控后的有效數(shù)據(jù)占原始數(shù)據(jù)的百分比均高于百分之多少（90%），當然所占百分比越高，本次測序的效果越好。

2. 然后我們可以描述一下稀釋曲線圖，稀釋曲線（Rarefaction curve）主要利用各樣本在不同測序深度時的微生物Alpha多樣性指數(shù)構建曲線，以此反映各樣本在不同測序數(shù)量時的微生物多樣性。若多樣性指數(shù)為sobs（表征實際觀測到的物種數(shù)目），當曲線趨向平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的物種，反之則表明繼續(xù)測序還可能產(chǎn)生較多新的物種，可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物多樣性信息。

3. 分類學注釋，總體描述本次測序結果，例如，本次測序共得到多少門、綱、目、科、屬、種、OTU。

圖1. 稀釋曲線圖

4. 物種組成分析

分類學組成分析，主要關注物種組成柱狀圖即可，這是測序中最基本的分析，通過該分析可以得到，每個樣本中有哪些物種組成，每個物種的相對豐度是多少。需要注意的是，該分析需要在具體的分類水平上看（門、綱、目、科、屬），由于二代測序在種水平上的準確率相對較低，所以在種水平上分析的較少，一般常在門和屬水平分析。描述可以從兩方面描述，一方面看主要的物種組成是什么（有哪些菌，在某一分類的具體水平），不同的比較組之間物種組成是否有差異。另一方面看同一物種的豐度在不同組間的差異，具體描述為升高或降低。從物種組成柱狀圖中就可以來比較不同組間物種組成是否有差異，但這個差異不具有顯著性之說。

圖2. 物種組成柱狀圖

1. Alpha多樣性分析

Alpha多樣性分析，稀釋曲線中已經(jīng)用到了了Alpha多樣性指數(shù)，這里的分析更加具體，可以對分組樣本進行比較，運用統(tǒng)計學T檢驗的方法，檢測每兩組之間的指數(shù)值是否具有顯著性差異。可以選擇自己要用的指數(shù)進行比較，一般常用豐富度指數(shù)Chao值，多樣性指數(shù)Shannon，具體描述可以是豐富度與多樣性指數(shù)升高或降低，不同組間指數(shù)是否有顯著差異。Alpha多樣性分析將樣本的菌群群整體研究并轉(zhuǎn)換為具體的指數(shù)與p值，通過數(shù)字說明群落的變化與差異，在文章中是不可或缺的。

圖3. Alpha多樣性指數(shù)圖

2. Beta多樣性分析

Beta多樣性分析，該分析是十分重要且常見的分析，幾乎所有的微生物測序文章中都會有此分析內(nèi)容，例如我們常見的PCoA、NMDS、PCA分析。通俗講就是每一個物種(ASV/OTU)在兩個樣本之間差異，即是反映這兩個樣本間群落差異的一個維度。而由于群落中物種的數(shù)量巨大，樣本間群落的差異往往是多維度的，難以進行直接比較。此時，就需要相關算法對多維數(shù)據(jù)進行降維。降維后的結果就是平面圖中樣本點的距離，通過距離的遠近代表樣本群落結構的相似與差異，這里要注意的是群落結構，因為我們是將每個樣本中的每個物種都進行了比較，不是只針對具體的某些物種，所以是從整體分析樣本之間的相似性與差異性。例如PCoA分析，我們要注意算法的選擇，如不考慮物種豐度的unweighted_unifrac，考慮物種豐度的weighted_unifrac，還有常用的bray_curtis，不同的算法會導致不同的結果，還需要各位投稿人結合自己的研究目的進行選擇。

圖4. PCoA分析

3. 組間差異顯著性分析

該分析需要與Beta分析結合使用，因為PCoA、NMDS等排序分析只是一種探索分析手段，并不是統(tǒng)計檢驗，對于排序圖中呈現(xiàn)的分布規(guī)律，我們需要使用檢驗手段進行驗證，常用的分析有Permanova，Anosim。我們在文章中將Beta分析與p值結合來說明，不同的處理是否使樣本之間的微生物群落結構產(chǎn)生顯著差異。需要注意的是顯著性分析的算法選擇要與Beta多樣性分析相一致。

5. 物種差異分析與標志物種

1. 韋恩圖

物種差異分析是所有老師最關注的分析。先來說韋恩圖，該分析可以知道不同的樣本間有哪些物種是共有的，哪些是獨有的，通過數(shù)據(jù)說話，如果共有的物種數(shù)占所有物種數(shù)的比例高，那么樣本的相似性就高。如果樣本中各自獨有的物種數(shù)所占比例高，那么樣本之間的相似性差，各自的獨特性高。

圖5. 樣本組Venn圖

2. 聚類熱圖

物種組成熱圖也是我們常見的分析，將物種豐度轉(zhuǎn)換成顏色色調(diào)的冷暖，此分析看起來難以理解，其實只是視覺上的錯覺。熱圖是在具體分類學水平分析所有樣本中總豐度排在前幾十的物種，一般是在屬水平進行分析。因為篩選了豐度，所以熱圖是對優(yōu)勢物種進行分析。此分析包括兩方面內(nèi)容，一方面可以描述比較具體某一優(yōu)勢物種在各個樣本中的豐度高低，另一方面是描述樣本的聚類情況，通過聚類樹可以知道優(yōu)勢物種組成在樣本之間的相似性和差異性。

圖6. 雙聚類的物種組成熱圖

3. 差異菌群的篩選

通過差異菌群篩選可以找出不同的處理組導致哪些菌群發(fā)生變化，豐度上具有顯著差異的物種，是擴增子測序的核心目的。例如常用的Metagenomeseq和Lefse分析。MetagenomeSeq主要用于兩組樣本的差異比較。Lefse的分析更加嚴格，可以進行多組比較，而且是在所有分類學水平同時進行分析。Lefse分析的結果包含了多級物種層級樹圖和LDA效應值柱狀圖，文章中放LDA效應值柱狀圖即可，LDA效應值柱狀圖需要注意效應值即該圖中的橫坐標值，文章中一般默認最低值為2，篩選出的物種為該組的標志物種，這些物種的豐度顯著高于在其他組中的豐度。

圖7. 基于分類等級樹的組間差異分類單元圖

圖8. 標志物種的LDA效應值柱狀圖

4. 功能預測分析

功能預測分析，由于擴增子測序是基因片段測序，不像宏基因組將整個基因組實際進行測序，所以擴增子測序只能是預測功能，與宏基因組的功能相比，預測到的信息是有限的。基于具體的功能數(shù)據(jù)庫進行注釋，得到功能通路豐度圖，通過功能預測可以知道有哪些功能，哪些功能的豐度相對高，也可以為進一步做宏基因功能提供參考，另外也使文章內(nèi)容更加完善。

圖9. 預測的KEGG二級功能通路豐度圖

6. 關聯(lián)網(wǎng)絡分析

關聯(lián)網(wǎng)絡分析，可以用來展示樣本與物種之間的分布情況，通過對不同樣本間的物種豐度信息進行相關性分析。在微生物生態(tài)學的關聯(lián)網(wǎng)絡圖中，每個點可以代表群落中的一個ASV/OTU，兩個點之間是正相關還是負相關可以通過連線的顏色進行區(qū)分。此分析的作用是探究樣本中是否存在關系緊密的微生物，發(fā)揮特定的功能，并影響整個群落的組成變化，所以文章中是否選擇此分析必須要結合老師的研究思路。

圖10. 關聯(lián)網(wǎng)絡分析

這里舉個例子，環(huán)境因子關聯(lián)分析，研究土壤的老師大都會收集土壤的各種理化因子做為環(huán)境因子數(shù)據(jù)，常見的分析如RDA和CCA分析，通過該分析可以反映環(huán)境因子、樣本、菌群三者之間的關系或者兩兩之間的關系，可得到影響樣本分布的重要環(huán)境驅(qū)動因子，文章中可以描述哪些環(huán)境因子顯著影響樣本的微生物群落。

圖11. CCA分析圖

總結

微生物擴增子測序中還有許多其它分析內(nèi)容，以上是一些常用的基礎分析，在文章結構設計時，可以選擇其中幾個分析進行組合，有些是必須要有的，有些則需要結合實驗研究目的進行選擇。對于初次接觸測序的老師，一定不要被分析圖片的美貌所引誘，看起來復雜和精美的圖片可能并不能很好的解釋我們要討論的結果，反而會增加分析難度，根據(jù)文章目的取材，掌握最基礎的分析內(nèi)容，足以支撐起一篇文章的結構。