研究細(xì)胞外囊泡(EV)的可靠生物活性和藥物發(fā)現(xiàn)需要開(kāi)發(fā)一種新的大規(guī)模純化方案。為了解決這個(gè)問(wèn)題，近日J(rèn)EV雜志上的一篇文章提出了一種通過(guò)使用陰離子交換法制備高性能外泌體(EXO)的有效方法。來(lái)自4L培養(yǎng)上清液的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)EV通過(guò)220nm截止過(guò)濾器分為兩個(gè)群體，去蛋白率超過(guò)99.97%，分別在低(0.15M–0.3M)和高NaCl濃度(0.3M–0.5M)條件下洗脫（分別約為2×10¹²和1.5×10¹²顆粒）通過(guò)陰離子交換柱色譜。前者富含EXO蛋白，包括晚期內(nèi)體相關(guān)蛋白和rab家族和整合素家族蛋白，以及功能性微(mi)RNA，并具有通過(guò)消耗原發(fā)性腫瘤病變中的間充質(zhì)細(xì)胞群來(lái)預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移的生物活性。相比之下，后者是微泡（MV）樣顆粒，包括DNA、核心組蛋白和核糖體蛋白，以及功能未知的富含GC的miRNA，容易被甘露糖受體+枯否細(xì)胞吞噬。因此，陰離子交換法適用于大規(guī)模分離具有生物活性的EXO和類(lèi)似MV的EV，后者攜帶高純度危險(xiǎn)核酸貨物。

包括免疫細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞會(huì)釋放脂質(zhì)雙層膜細(xì)胞外囊泡(EV)，例如晚期內(nèi)體衍生的外泌體(EXO，也稱為小EV)和質(zhì)膜出芽形成微泡(MV，也稱為大EV，包括凋亡小體、oncosomes和ectosomes)，直徑分別為50-200和100-2000nm（直徑約為100-200nm的EV是EXO和MV的混合物）。最近報(bào)道了直徑小于50nm的非膜外泌顆粒（exomeres）。EXO來(lái)源于內(nèi)溶酶體系統(tǒng)，并通過(guò)由外泌體標(biāo)記蛋白（例如凋亡相關(guān)基因2相互作用蛋白X(Alix)和腫瘤易感基因(Tsg)101）介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)所需的內(nèi)體分選復(fù)合物 (ESCRT)介導(dǎo)多泡體[MVB]作為腔內(nèi)囊泡(ILV)生成，并通過(guò)MVB與質(zhì)膜融合而釋放。然而，通過(guò)已知的ESCRT依賴性和非依賴性EXO形成途徑以及來(lái)自腫瘤細(xì)胞系的EV中微(mi)RNA和蛋白質(zhì)的不同包裝機(jī)制，從單個(gè)細(xì)胞系釋放的EV是結(jié)構(gòu)異質(zhì)的群體。在臨床使用的EV藥物發(fā)現(xiàn)中，關(guān)鍵是根據(jù)其功能確定顆粒類(lèi)型并盡可能對(duì)其進(jìn)行分離和純化。

與質(zhì)膜來(lái)源的MV不同，據(jù)預(yù)測(cè)，EXO膜富含由以鞘磷脂和神經(jīng)節(jié)苷脂為代表的鞘脂，已知它們通過(guò)阻斷神經(jīng)酰胺生物合成和積累四跨膜蛋白分子（如CD9、CD63和CD81）來(lái)防止晚期內(nèi)體中的ILV出芽；另外還富含糖基-磷脂酰肌醇錨定蛋白，例如CD90、G蛋白偶聯(lián)受體和膽固醇。據(jù)報(bào)道，在一項(xiàng)使用具有高分辨率密度梯度的分級(jí)EV的研究中，EXO不含DNA。此外，一份報(bào)告指出，在前列腺癌患者的血漿中，大型EV而非小型EV含有DNA。所有類(lèi)型的EV都被廣泛認(rèn)為表現(xiàn)出負(fù)電荷，因?yàn)槲挥诨罴?xì)胞質(zhì)膜內(nèi)葉的陰離子磷脂酰絲氨酸(PS)暴露在EV膜的外葉上，如同死細(xì)胞那樣。有趣的是，一些研究報(bào)告稱，與其他EV相比，EXO對(duì)PS結(jié)合蛋白AnnexinV和lactadherin的親和力較弱，這表明EXO可以根據(jù)細(xì)胞膜負(fù)電荷的差異與源自質(zhì)膜的EV分離。

基于超速離心(UC)的分離技術(shù)被廣泛用作表征EV生物學(xué)意義的金標(biāo)準(zhǔn)方法。除了無(wú)法區(qū)分MV、EXO和exomeres外，在應(yīng)用UC方法時(shí)，培養(yǎng)上清液中的不溶性聚集蛋白也會(huì)與EV一起沉淀。在定量實(shí)驗(yàn)固有的困難下，EV之間的聚集以及培養(yǎng)基衍生蛋白質(zhì)與EV的非特異性結(jié)合顯著損害了UCEV生物活性的可靠性。使用碘克沙醇的密度梯度離心和使用對(duì)CD9、CD63和CD81四跨膜蛋白分子特異的mAb以及對(duì)PS特異的T細(xì)胞免疫球蛋白和含有粘蛋白結(jié)構(gòu)域的分子4(TIM-4)的親和分離經(jīng)常用于EV制備。盡管基于密度梯度和親和力的方法可以獲得高純度的EV，但很難制備大量EV用于物理化學(xué)分析和研究EV的詳細(xì)生物學(xué)特性。此外，在PS靶向制備方法中，可能會(huì)遺漏具有低負(fù)膜電荷的EV。

DEAE柱色譜法在低鹽濃度下洗脫生物活性CTL EV

作者此前在鼠類(lèi)研究中闡明，CD8+CTL EV通過(guò)其內(nèi)容物（例如miR-298-5p）調(diào)節(jié)原發(fā)性腫瘤病變中的間充質(zhì)細(xì)胞群來(lái)預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移。這項(xiàng)研究描述了一種基于這種生物學(xué)特性的高純度大規(guī)模EV制備方法，使用陰離子交換法，并闡明了詳細(xì)的生理特征，包括蛋白質(zhì)、膜脂和miRNA分布以及DNA含量，表面糖基化和靶細(xì)胞特異性。得出結(jié)論，陰離子交換法最適合臨床應(yīng)用中符合良好生產(chǎn)規(guī)范(GMP)的EV制備。

純化的L-s和H-s CTL EV的形態(tài)和粒徑差異

參考文獻(xiàn)：

SeoN, Nakamura J, Kaneda T, Tateno H, Shimoda A, Ichiki T, Furukawa K, HirabayashiJ, Akiyoshi K, Shiku H. Distinguishing functional exosomes and otherextracellular vesicles as a nucleic acid cargo by the anion-exchange method. JExtracell Vesicles. 2022 Mar;11(3):e12205. doi: 10.1002/jev2.12205.PMID: 35289089.