免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICI）給50%以上的非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者帶來了生存獲益[1]；然而還是有很多患者無法從治療中獲得益處，而且接受免疫治療的部分患者還會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)。

因此，如何準(zhǔn)確地識(shí)別出哪些患者可以從免疫治療中受益，最大限度地提高療效和減少毒性，一直是科學(xué)家們努力奮斗的方向之一。

腫瘤突變負(fù)荷（TMB）是一種有前景的生物標(biāo)志物，它是腫瘤基因組中每個(gè)編碼區(qū)的體細(xì)胞突變總數(shù)。已有研究發(fā)現(xiàn)高TMB腫瘤可能會(huì)產(chǎn)生更多新抗原，進(jìn)而引發(fā)更強(qiáng)地抗腫瘤免疫反應(yīng)[2,3]。

早在2020年，FDA就批準(zhǔn)了FoundationOne CDx（F1CDx）用于不可切除或轉(zhuǎn)移性高TMB實(shí)體瘤患者進(jìn)行基于組織腫瘤突變負(fù)荷（tTMB）的評(píng)估，以10mut/Mb為臨界值來決定在哪些患者中使用帕博利珠單抗[4]。

但是，tTMB評(píng)估需要對(duì)患者進(jìn)行有創(chuàng)操作，存在固有并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。此外，活檢取材少，可能會(huì)導(dǎo)致DNA量不足而影響分析結(jié)果[5]。而基于血液腫瘤突變負(fù)荷（bTMB）不僅可以彌補(bǔ)tTMB檢測的缺陷，還可以避免原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性病變之間的空間腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。

近日，由羅氏Daniel Klass領(lǐng)銜的研究團(tuán)隊(duì)，在Journal for ImmunoTherapy of Cancer上發(fā)表重要研究成果[6]。他們基于bTMB，設(shè)計(jì)了肺TMB面板，用于檢測I期至IV期NSCLC患者。

結(jié)果顯示：當(dāng)以tTMB臨界值16mut/Mb為判定標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，1.1Mb的肺TMB面板具有高度準(zhǔn)確的TMB檢測響應(yīng)性，陽性預(yù)測值（PPV）為95%，相當(dāng)于bTMB的42mut/Mb；但bTMB的陽性符合率（PPA）相對(duì)較低，為32%。但在IV期NSCLC患者中，且cfDNA輸入量至少為20ng時(shí)，bTMB的PPA可以提高到63%，并且可以將檢測面板最小化到577kb。

這一結(jié)果有望使bTMB成為NSCLC患者免疫治療的預(yù)測性生物標(biāo)志物。

論文首頁截圖

Klass團(tuán)隊(duì)這項(xiàng)研究納入的183名I-IV期NSCLC患者樣本，來自LEMA試驗(yàn)（NCT02894853），包括183份固定石蠟包埋組織（FFPET）、178份血漿和170份全血樣本。

首先，研究人員利用已有~2.2M的tTMB檢測面板對(duì)183份腫瘤組織樣本進(jìn)行分析，結(jié)果顯示tTMB檢測面板的TMB中位值高于TCGA數(shù)據(jù)庫中肺癌、腺癌和鱗狀細(xì)胞癌樣本的全外顯子測序（WES）分析值（13.9 vs 7.6）。此外，in-silico模擬比較顯示tTMB面板與FDA批準(zhǔn)的F1CDx面板具有良好的相關(guān)性（R2=0.99）。

接下來，Klass團(tuán)隊(duì)利用CAPP-Seq面板設(shè)計(jì)算法，盡可能設(shè)計(jì)一個(gè)較小的、且突變最大化的、用于肺TMB檢測的血漿面板，以使每個(gè)樣本的檢測成本最小化。研究人員以覆蓋關(guān)鍵基因的約300Kb為核心，每次添加約50Kb，最終形成一個(gè)約1.1Mb的肺TMB面板，覆蓋965個(gè)基因的外顯子區(qū)域。

緊接著，研究人員用肺TMB面板對(duì)178份血漿樣本進(jìn)行分析，結(jié)果顯示測序深度與cfDNA輸入量密切相關(guān)，當(dāng)cfDNA輸入量大于30ng，測序深度大于3000，表明該面板檢測突變高度準(zhǔn)確。

為了評(píng)估肺TMB面板的臨床效果，研究人員利用Rizvi等人發(fā)表的NSCLC隊(duì)列WES數(shù)據(jù)進(jìn)行了in-silico模擬評(píng)估[7]。結(jié)果顯示，WES臨界值（10 mut/Mb）轉(zhuǎn)換后相當(dāng)于肺TMB面板的19.3 mut/Mb。

此外，在持久臨床獲益（DCB）和無持久臨床獲益（NDB）患者中，與WES相比，肺TMB面板對(duì)兩類患者的分離效果更強(qiáng)（p=0.002），在對(duì)無進(jìn)展生存（PFS）率的改善預(yù)測分析中，同樣地，肺TMB面板分離效果更強(qiáng)（p=0.0039, HR=4.023）。

肺TMB面板可以將DCB和NDB患者分開，同樣可以將不同PFS率的患者分開

為了比較腫瘤組織TMB面板與肺TMB面板的TMB值，研究人員利用肺TMB面板重新捕獲組織樣本，并確定兩個(gè)面板間TMB值的相關(guān)方程，分析顯示組織面板中16mut/Mb對(duì)應(yīng)于肺TMB面板中42mut/Mb。

研究人員利用tTMB臨界值16 mut/Mb，進(jìn)一步評(píng)價(jià)血漿和腫瘤組織間TMB分類（TMB-H和TMB-L）的一致性，結(jié)果顯示肺TMB面板檢測TMB-H的PPV同樣很高（91%-100%），表明血漿檢測準(zhǔn)確性很好。但是肺TMB面板檢測TMB-H的PPA較低（24%-32%），表明敏感性較低。

考慮到血漿面板PPA較低，研究人員認(rèn)為可能與早期或脫落率較低腫瘤所提取的cfDNA量少相關(guān)。分析結(jié)果顯示，cfDNA輸入量的增加，組織和血漿TMB之間的相關(guān)性得到明顯改善。通過分析，研究人員建議要至少輸入20ng cfDNA，才能準(zhǔn)確、可重復(fù)地評(píng)估bTMB[8]。

cfDNA輸入量對(duì)bTMB評(píng)估的影響

接著，研究人員又分析了腫瘤負(fù)荷對(duì)bTMB評(píng)估的影響。結(jié)果顯示，腫瘤負(fù)荷大于0.1%等位基因頻率的樣本，組織和血漿間TMB值具有較好的相關(guān)性。

由于腫瘤負(fù)荷與腫瘤分期相關(guān)，研究人員進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，I、II、III、IV期疾病患者的樣本，其bTMB的PPA從0%逐漸上升到11%、35%、54%，且在IV期NSCLC患者樣本中，組織和血漿間TMB值相關(guān)性最強(qiáng)。

然后，研究人員將cfDNA輸入量、腫瘤負(fù)荷和腫瘤分期三者相結(jié)合進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)僅限于來自IV期、cfDNA>20ng患者的樣本，在組織TMB臨界值為16mut/Mb時(shí)，血漿高TMB患者的PPV和PPA分別為100%和63%。

cfDNA輸入量、腫瘤負(fù)荷和腫瘤分期三者相結(jié)合的分析

最后，為最大限度地減小肺TMB測序面板，研究人員對(duì)設(shè)計(jì)過程中面板子集進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與1.1 Mb肺TMB面板相比，至少約577 kb的面板具有相似的檢測性能和臨床相關(guān)性。

總的來說，本研究設(shè)計(jì)開發(fā)的bTMB檢測面板，成本效益高、檢測精度高，且明顯小于以前設(shè)定的最小值（1Mb），因此bTMB有望成為判斷NSCLC患者能否接受ICI治療的預(yù)測性生物標(biāo)志物。