【原】人胚胎肝細(xì)胞的培養(yǎng)實驗操作方法

生物學(xué)渣 2022-05-13

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隨著各型肝炎、肝硬化、肝癌等慢性肝病的發(fā)病率日益升高，體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞也被廣泛地用千肝病基礎(chǔ)研究中。盡管細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)不斷改進(jìn)和成熟，國內(nèi)外也先后建立了多株人肝癌細(xì)胞系，但體外分離和培養(yǎng)人正常肝細(xì)胞仍是非常有價值的研究材料。

一

材料與設(shè)備

1. 設(shè)備與器材超凈工作臺、離心機、CO2 培養(yǎng)箱、－70℃ 冰箱、－20℃冰箱。

2. 無菌材料大培養(yǎng)皿、青霉素小瓶、50ml 離心管、刻度吸管、彎頭吸管、T25 培養(yǎng)瓶、手術(shù)剪、刀、鏤、細(xì)胞篩（ 100 目）、消毒用乙醇棉球、流產(chǎn)胚胎、高糖DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清、青／鏈霉素、D-Hanks 溶液、0.25％胰蛋白酶/0.03%EDTA 消化液。

二

操作步驟

1. 消化法

（1）流產(chǎn)胚胎引出后，于4℃ 保存，并盡快運輸至實驗室。

（2）將胚胎置大培養(yǎng)皿中，用乙醇棉球?qū)⑴咛ミM(jìn)行整體擦拭消毒。

（3）持手術(shù)鑷、剪，從胚胎腹部切口，向下擴，取出肝臟，去除外膜后，用D-Hanks 溶液（含雙倍雙抗）洗滌3~5 次，至組織呈灰白色。

（4）將組織剪碎至1mm3，移入青霉素小瓶，加少量D-Hanks 溶液混勻，用彎頭吸管將剪碎的組織移至50ml 離心管中加D-Hanks 溶液清洗，然后以每分1000 轉(zhuǎn)的速率離心6min。

（5）棄去上清液，加入15ml 的0.25% 胰蛋白酶／0.03%EDTA 消化液于室溫下消化15min, 然后用吸管混勻，靜置幾秒鐘，待組織塊沉淀后棄去上清液。

（6）重新加入新鮮消化液15ml 消化10~15min, 混勻后將上清液（此時懸液中已含有消化下來的細(xì)胞）移入另一離心管，并用含20% 血清的DMEM 培養(yǎng)液終止消化，然后向原離心管中重新加入10~15ml 消化液消化，重復(fù)3~4 次。

（7）將消化后收集的細(xì)胞懸液混合，過細(xì)胞篩。

（8）篩后的細(xì)胞懸液移入離心管中，每分鐘1000 轉(zhuǎn)的速率離心6min , 棄去上清液，用含20％胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液混勻，此時可在計數(shù)板計數(shù)，然后將細(xì)胞懸液按每瓶6~8ml（含細(xì)胞量1 x106個）移入T25 培養(yǎng)瓶中，于37℃ 、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日，觀察細(xì)胞貼壁情況，棄去舊液，用D-Hanks 溶液洗后，換新鮮培養(yǎng)液于37℃ 、5%CO2 培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

（9）原代培養(yǎng)的第三天，細(xì)胞長至80%~90% 匯合時，進(jìn)行第一次傳代。以后每3~ 4d 傳代1次。按常規(guī)1: 3 傳代方法進(jìn)行操作。

2. 組織塊貼壁法

（1）流產(chǎn)胚胎引出后，于4℃ 保存并運輸至實驗室。

（2）將胚胎置大培養(yǎng)皿中，用乙醇棉球?qū)⑴咛ミM(jìn)行整體擦拭消毒。

（3）持手術(shù)鑷、剪，從胚胎腹部切口，取出肝臟，去除外膜后，用D-Hanks溶液（含雙倍雙抗）洗滌3 ~5 次，至組織呈灰白色。

（4）將組織剪碎至1mm3, 移入青霉素小瓶，然后吸入D-Hanks 溶液清洗2~

3 次。

（5）將組織塊移入T25 培養(yǎng)瓶，用彎頭吸管將組織塊輕輕剝離成單個，并均勻貼附在瓶壁，然后將貼附有組織塊的培養(yǎng)瓶移入培養(yǎng)箱，翻轉(zhuǎn)倒置4~6h, 至組織塊貼牢。

（6）加入6~8ml 含20％胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，于37°C 、5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

（7） 3~7d 后于鏡下觀察，組織塊周圍會有細(xì)胞長出，細(xì)胞長多后就可看到“生長暈“。

（8）原代培養(yǎng)過程中應(yīng)保證每3d 換1 次培養(yǎng)液，細(xì)胞長至7~ 10d 時可進(jìn)行第一次傳代。以后每3~4d 傳代1 次。按常規(guī)1 : 3 傳代方法進(jìn)行操作。

三