小分子一直是分子互作研究的熱門對象，通常指分子量小于1000道爾頓的分子，如化藥、中藥、多肽、植物激素、金屬離子等。小分子相互作用檢測由于其分子量小，響應(yīng)值低，親和力弱等特點，對儀器靈敏度提出了很高的要求。Biacore靈敏度最高可達(dá)0.015RU，無分子量檢測下限，優(yōu)于市面同類產(chǎn)品技術(shù)上百倍，一天可分析多達(dá)400個樣品。因此，Biacore成為了小分子互作檢測的必備工具。
Biacore在小分子領(lǐng)域的研究涉及了生命活動的很多方面，如：
(1) 化藥研發(fā)
(2) 多肽研究
(3) 中藥活性成分研究
(4) 植物激素
(5) 食品含量測定
(6) 農(nóng)藥殘留檢測
(7) 疾病的分子機(jī)理研究等
接下來使用BiacoreT200儀器，解析蛋白與小分子互作實驗操作流程。

Biacore T200 檢測蛋白與小分子互作操作指南

實驗前準(zhǔn)備
·   S 系列 CM5 芯片，貨號：29-1049-88( 一片裝 )、BR-1005-30( 三片裝 )、29-1496-03( 十片裝 )，若蛋白與小分子的分子量比大于 100，換用 S 系列 CM7 芯片。( 注：每張芯片若一次性使用，可檢測三對不同的互作，若再生后重復(fù)使用，只要蛋白一直有活性，就可一直使用 )。
·   氨基偶聯(lián)試劑盒( 貨號：BR-1000-50),( 注：里面的 EDC 和NHS，溶解后，200ul 每管分裝，-20℃凍存， 后續(xù)實驗前，各取一管融化后使用即可 )。
·   偶聯(lián) Buffer：10mM 醋酸鈉 pH4.0( 貨號：BR-1003-49) 或 10mM 醋酸鈉 pH4.5( 貨號：BR-1003-50)。

·   緩沖液：10 x PBS-P+ ( 貨號：28-9950-84)。

·   分析純 DMSO，去離子水 (0.22 μm 膜過濾，若純水儀已含該濾芯，可無需再次過濾直接使用 )。

·   蛋白：濃度一般需大于 0.5 mg/ml。蛋白總量至少 20 μg 以上。

·   小分子 LMW：母液濃度建議大于 20 mM，體積在 30 μL 以上，純度 >90%，溶在 100% DMSO 里。

·   其他耗材：無蓋 1.5 ml EP 管( 貨號：BR-1002-87)，橡膠瓶蓋 2 型( 貨號：BR-1004-11)，96 孔板( 貨號：BR-1005-03)，96 孔板封口膜 ( 貨號：28-9758-16)。

實驗步驟
芯片的放置與緩沖液置換
·   將運(yùn)行緩沖液 (200 mL 1×PBS Buffer 即可 )，水瓶，廢液瓶分別放置在左右托盤中，并插入相應(yīng)的進(jìn)液管。
·   點擊 Biacore T200 Control Software 工具條中的 或 點擊 Eject Chip，打開芯片艙門。選擇 New Chip，現(xiàn)在 Chip type 為 CM5。

·  手持芯片，有字的一面朝上。按照芯片上的箭頭方向，將芯片輕輕推入卡槽，最后合上芯片艙的艙門。點擊 Dock Chip。結(jié)束后，選擇 Tools → Prime 命令，點擊 Start。結(jié)束后，點擊 Close，系統(tǒng)自動轉(zhuǎn)入待機(jī) (Standby) 狀態(tài)。

蛋白偶聯(lián)
·   點擊控制軟件 File 下面的 Open/New wizard template，選擇 immobilization，雙擊。在 Chip type 中選 CM5，在 Flow cells per cycle 選 1。勾選 Flow cell 2 (如 2 已用，可選擇 4)，method 選用 amine， Ligand 輸入配體名稱，選用 specify contact time and flow rate 實現(xiàn)高偶聯(lián)，按下表輸入 contact time，本次實驗輸入 900s。點擊 2 次 Next。

表 1. 偶聯(lián)量與配體工作濃度參考表

·   在左側(cè)下拉菜單中選用Sample and Reagent Rack 1，在 Menu 里選Automatic Positioning 自動排放樣品位置或自行通過鼠標(biāo)拖拽到指定位置。根據(jù)下圖中樣品名稱及體積( 大于該指定體積即可 ) 進(jìn)行樣品準(zhǔn)備。其中配體蛋白用 pH4.0 的醋酸鈉稀釋至 50 μg/mL ( 或按上表配制相應(yīng)濃度 )。點擊左下方 Eject Rack，取出樣品架，將準(zhǔn)備好的樣品放到對應(yīng)位置。蓋上試管架蓋子，將樣品架送回樣品艙。( 注：所有 EP 管的蓋子務(wù)必剪去 )。
  

·   點擊 Next，點擊 start，保存 method 與 result 文件。系統(tǒng)將自動在芯片表面包被目標(biāo)偶聯(lián)量的配體蛋白，并自動生成偶聯(lián)報告。
·   偶聯(lián)結(jié)束后，即可進(jìn)入下一步實驗，無需等待基線平衡。

運(yùn)行緩沖液及樣品配置
·   配置運(yùn)行緩沖液和溶劑校正曲線

小分子樣品的運(yùn)行緩沖液選用含 5%DMSO 的 1×PBS-P+（視樣品溶解性可調(diào)整 DMSO 含量，最高不超過 10%）
取 105 mL 10×PBS-P+ 用去離子水稀釋到 1L，配成 1.05×PBS-P+。并按照下表，加入 DMSO，配置5%DMSO 運(yùn)行緩沖液和 4.5%、5.8% 溶劑校正母液（running buffer 中 DMSO 濃度并非絕對 5%，可視小分子樣品溶解度情況而定，0-10% 均可。若 running buffer 中 DMSO 濃度變化，則溶劑校正母液也相應(yīng)變化，只要 cover running buffer 中 DMSO 濃度即可）。將系統(tǒng)左側(cè)托盤中的原運(yùn)行緩沖液換成含 5%DMSO 的 1×PBS-P+，并插入相應(yīng)的進(jìn)液管。

按照下表混合 4.5% 和 5.8% 母液配置 5%DMSO 濃度校正曲線(DMSO 標(biāo)準(zhǔn)液的數(shù)量并非一定要 8 個， 通常 4-8 個均可。總體積也并非一定要 1.4ml，這些均可根據(jù)實際情況自行調(diào)整 )

·   小分子樣品準(zhǔn)備

用不含 DMSO 的 1.05×PBS-P+ 緩沖液稀釋 20 mM 小分子母液 20 倍，得到 1 mM 含 5%DMSO 的1×PBS-P+ 中的小分子 400 μL，再用配好的含 5% DMSO 的 Running Buffer 將分析物向下三倍稀釋 10個濃度梯度 ( 各 200 μL)，分別是 1000 μM, 333.3 μM, 111.1 μM, 37 μM, 12.3 μM, 4.1 μM, 1.37 μM, 0.46μM, 0.15 μM, 0.05 μM。間隔設(shè)置一個重復(fù)濃度，增加一個 0 濃度。

多循環(huán)動力學(xué)檢測
·   點擊控制軟件 File 下面的 Open/New Method，然后雙擊打開 Biacore Methods，再雙擊 LMW kinetics。
·   在 General Settings 界面，將 Concentration unit 改為 μM，Detection 改為 Dual，若 flow cell 2,3,4 都偶聯(lián)了蛋白，Detection 下面可以選 Multi，后面對應(yīng)的第 5 步可選 2-1,3-1,4-1，其他不做修改。

·   在Assay Steps 界面，可以調(diào)整檢測項目和重復(fù)次數(shù)。Startup 和sample 的重復(fù)次數(shù)通常分別為3 和1， solvent correction 通常檢測開始時一次，結(jié)束時一次，每隔 30cycle 一次。檢測溫度默認(rèn) 25 度，也可根據(jù)需要進(jìn)行修改等。如無 control sample，可在此頁面選擇 control sample 后，點擊左側(cè) Delete 按鈕，將其刪除。
·   在 Cycle Types 界 面，選擇 LMW kinetics，點擊下方 Sample1，將 Contact time 改為 60s， Dissociation time 改為 120s。其他項無需修改。Extra wash 用 50%DMSO 清除管路中殘留的小分子(extra wash 不流經(jīng)芯片表面，不會影響配體活性 )。
  

·    點擊 Verification，如果方法有問題，在此頁面會報錯，并根據(jù)報錯提示返回相應(yīng)步驟進(jìn)行修改。如果無問題，點擊 setup Run。在 detection 界面將 Flow path 點為 2-1 或 4-3（具體視蛋白偶聯(lián)的通道而定）。

·   點擊 next， 進(jìn)入分析物信息填寫。Startup 中 Sample solution 填寫 PBS-P+，Sample 中 Sample solution 填寫樣品名稱，Conc 填寫分析物系列濃度（由低到高、三倍稀釋）。注意要設(shè)置重復(fù)濃度和零濃度。推薦濃度如下：

 
·  點擊 3 次 Next，進(jìn)入 Rack Positions 界面，將 Reagent Rack 改為 Sample and Reagent Rack1（若需要用96/384 孔板，則選擇Reagent Rack1 或2，同時在下方96 well microplate 中選擇對應(yīng)的孔板類型）。點開 Menu 后選 Automatic Positioning 進(jìn)入下面界面后， Vial Size 根據(jù)需求進(jìn)行調(diào)整，1.5 mL EP 管請選擇 medium，pooling 選擇 Yes（相同的樣品會自動合并），點擊 OK。點擊左下方 Eject Rack， 取出樣品架。根據(jù)圖示樣品位置進(jìn)行放置，放入樣品體積略大于顯示體積即可。注：所有 EP 管的蓋子務(wù)必剪去。蓋好橡膠蓋防止揮發(fā)，并按指定位置放置。蓋上試管架蓋子，將樣品架送回樣品艙。點擊 Next，對方法進(jìn)行保存，再對數(shù)據(jù)路徑（可使用系統(tǒng) 默認(rèn)的，也可自行指定，注意所保存的文件名及指定文件夾名均不能有中文字符）進(jìn)行保存，儀器便會開始自動運(yùn)行。

結(jié)果分析
·   打開 Biacore T200 Evaluation Software，點擊  ，找到保存的結(jié)果文件。點擊左側(cè) Plot 中的Binding to reference，檢查各個點是否趨于一致或小于 binding level 中對應(yīng)響應(yīng)值的 20%，再檢查binding level 各個點的響應(yīng)值是否存在明顯的濃度依賴。如是，直接跳到下一步。注：若 Binding to reference 各個點的響應(yīng)值也存在濃度依賴且大于binding level 中對應(yīng)響應(yīng)值的 20%，即存在非特異性結(jié)合。此時可嘗試提高運(yùn)行緩沖液中鹽離子濃度或提高 P20（貨號：BR-1000-54）濃度不超過 1%。若 baseline 中各個點的響應(yīng)值上飄，可加入再生步驟。
·   點擊 solvent correction 進(jìn)行溶劑校正分析。溶劑校正曲線一般要求落在 -500 到 +1000RU，兩條豎線落在矯正曲線范圍內(nèi)，擬合的 Chi2 小于 2。如果超出此范圍較多，多由于 DMSO 濃度配置不準(zhǔn)確造成。最后，點擊 OK。
 

·   點擊上方中間位置的 Kinetics/Affinity，在下拉欄里點擊 Surface bound。在跳出的窗口中選擇合適的、至少 5 個連續(xù)濃度進(jìn)行擬合。不需要的濃度，可在樣品濃度表格中將此濃度前的對號去掉即可。Curve 選擇 FC=2-1corr（或 FC=4-3corr）。

·  點擊右下角 Next，選擇右下角 Affinity（當(dāng)傳感圖為 “ 時間依賴的動力學(xué)特征 ” 時，選 Kinetics，所以本實驗也可用 kinetic 擬合），點擊 Next，Model 選擇 Steady State Affinity，點擊左上角 Fit 進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，點擊右下角Finish 完成。經(jīng)擬合，小分子LMW 與該蛋白pro 的親和力KD=1.427x10-4 M。（對于親和力擬合，KD 豎線最好落在樣品濃度范圍內(nèi)，并盡量小于最高濃度的一半位置，若 KD 豎線＞最高濃度，則可提高進(jìn)樣濃度梯度，或在上一步選擇更高濃度的、至少 5 個連續(xù)濃度的樣品進(jìn)行擬合。)
 
 

·   將鼠標(biāo)放在圖上，點擊右鍵可以直接 copy graph（small，medium，large）用于文章發(fā)表，也可以右鍵點擊 export curve，導(dǎo)出 txt 文本后自行用第三方軟件作圖。