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文獻(xiàn)分享——2014-在白血病患者中識(shí)別Pre-leukaemic HSCs

內(nèi)容目錄

前言關(guān)于作者背景知識(shí)克隆性造血相關(guān)內(nèi)容白血病細(xì)胞相關(guān)內(nèi)容NPM1基因PART1-非白血病細(xì)胞中DNMT3A突變的檢測(cè)PART2-DNMT3A突變的HSCs仍可多系分化PART3-Pre-leukaemic HSCs可以耐受化療PART4-Pre-leukaemic HSCs的克隆擴(kuò)增討論后記

前言

今天回過(guò)頭來(lái)看之前看過(guò)的一篇文章，發(fā)現(xiàn)有的居然已經(jīng)忘了一大半了，又得從頭來(lái)看，真的比較費(fèi)時(shí)間。所以，干脆一次辛苦，方便以后了，把主要的內(nèi)容整理成筆記好了。

這次的文章是以色列威茨曼研究所的Shlush在2014年發(fā)表在Nature上的一篇研究：

論文標(biāo)題：Identification of pre-leukaemic haematopoietic stemcellsinacuteleukaemia  

論文地址：https://www./articles/nature13038

關(guān)于作者

這里有2個(gè)共一作者：Liran I. Shlush  和 Sasan Zandi，通訊作者是John Dick。

其中關(guān)于Shlush，我們都相對(duì)比較熟悉了，目前在威茨曼研究所。Zandi和Shlush一樣，過(guò)去都是在John Dick Lab里做研究，現(xiàn)在也都畢業(yè)了。

放一個(gè)他們lab的網(wǎng)站，有興趣的話自己去看看吧：

John Dick Lab：http://www./

背景知識(shí)

克隆性造血相關(guān)內(nèi)容

• 通過(guò)比較確診AML和那些復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的患者樣本，發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移個(gè)體中的主要致病克隆和初診時(shí)的克隆不相同，而是一些初診時(shí)的小克隆。

• 初診時(shí)的小克隆是日后疾病復(fù)發(fā)的根源

• 只有一小部分在AML原始細(xì)胞中存在的突變，可以在AML患者體內(nèi)分離的HSC中找到。但是這些攜帶這些突變的HSC是可以正常向下分化的（其實(shí)也就是所謂的克隆性造血現(xiàn)象）。

白血病細(xì)胞相關(guān)內(nèi)容

• AML中blast細(xì)胞的免疫表型：CD33+ CD45^dim

CD33是髓系細(xì)胞分化抗原，分子量為67KD，主要分布在髓系血細(xì)胞，特別是在分化的早期階段。CD33在90%以上的急性髓系白血病患者都有表達(dá)。

這里要注意：CD33是可以在髓系血細(xì)胞表達(dá)的，如果想要表示AML中blast細(xì)胞，則還要加上CD45^dim

NPM1基因

NPM1基因位于染色體5q35，其編碼的核磷蛋白具有多種重要的功能，如阻礙核仁蛋白的聚集，調(diào)節(jié)核糖體蛋白的裝配以及這些蛋白在核與質(zhì)之間的轉(zhuǎn)運(yùn)，啟動(dòng)中心體的折疊，具有分子伴侶作用，并可通過(guò)多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡。NPM1 基因突變?cè)?AML 的發(fā)生和發(fā)展中起到重要的作用。

NPM1突變常發(fā)生于12號(hào)外顯子，目前報(bào)道的有40多種不同的突變類(lèi)型, 其中以A型突變最常見(jiàn)，約占70%-80%，表現(xiàn)為在第960-961位核苷酸之間插入TCTG。

盡管NPM1突變的類(lèi)型不一，但均屬于移碼突變，導(dǎo)致核定位信號(hào)異常，從而使核磷蛋白由核內(nèi)易位于胞質(zhì)，該異常定位不但可影響蛋白質(zhì)的正常功能，同時(shí)對(duì)某些腫瘤抑制基因ARF、P53 的正常通路及功能也產(chǎn)生一定的影響。

NPM1基因突變的發(fā)生率在FAB各亞型中亦具有異質(zhì)性，見(jiàn)于除M3外的各亞型，在M4和M5中發(fā)生率較高。

NPM1基因突變是AML預(yù)后相對(duì)較好的判斷指標(biāo)。這可能與NPM1突變患者對(duì)化療藥物較敏感有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)在AML中，核轉(zhuǎn)錄因子NF-KB的活化是白血病細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性的主要原因，在NPM1突變的白血病細(xì)胞中，核磷蛋白由核內(nèi)易位于胞質(zhì)，與胞漿中的NF-KB蛋白相互作用，導(dǎo)致NF-KB被分解，活性降低，從而減弱NF-KB與DNA的結(jié)合能力，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。

注意：當(dāng)NPM1基因突變后，可以直接寫(xiě)成NPM1c

PART1-非白血病細(xì)胞中DNMT3A突變的檢測(cè)

1. 使用深度靶向測(cè)序技術(shù)，對(duì)12個(gè)初診AML患者的外周血DNA進(jìn)行靶向測(cè)序，主要針對(duì)的靶基因有103個(gè)：

主要針對(duì)CD33+的AML細(xì)胞和作為正常對(duì)照的T細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序：

• 4/12人有DNMT3A突變（9，10，11，12）

• 3/4人中正常T細(xì)胞內(nèi)也可以找到突變（9，11，12）

• 在AML細(xì)胞中的DNMT3A突變VAF值較高，而正常T細(xì)胞中的DNMT3A突變VAF值較低

1. 為了看一看在AML患者中DNMT3A突變的情況，作者又找來(lái)一批樣本——71個(gè)確診為AML的患者，取初診時(shí)患者體內(nèi)正常遺傳學(xué)的血細(xì)胞進(jìn)行一代sanger測(cè)序：

• 17/71人有DNMT3A突變，突變率約24%

• 15/17人有NPM1c突變，且這2個(gè)突變的VAF大致相同

1. 找到這些樣本后，對(duì)這17個(gè)人做ddPCR（定量分析）檢測(cè)VAF值，結(jié)果如上圖：

• 在CD33+的AML細(xì)胞中，DNMT3A和NPM1c突變的VAF非常相似。

• 在正常T細(xì)胞中，12/17人有DNMT3A突變，而NPM1c檢測(cè)不到。

1. 又對(duì)其中2個(gè)樣本檢測(cè)了FLT3-ITD：

可以看到其中：在CD33+的AML細(xì)胞中可以發(fā)現(xiàn)有FLT3-ITD的存在，而在正常T細(xì)胞中基本上沒(méi)有，在第2個(gè)患者中的MLP細(xì)胞中有發(fā)現(xiàn)。

由此作者推斷說(shuō)，突變發(fā)生有一定的順序：

• 早期先有DNMT3A突變

• 而后出現(xiàn)NPM1c和FLT3-ITD

這樣推斷的話，其實(shí)也還算是有邏輯性的吧。

PART2-DNMT3A突變的HSCs仍可多系分化

為了探索DNMT3A突變細(xì)胞起源，因?yàn)槟壳罢J(rèn)為DNMT3A先在正常細(xì)胞中出現(xiàn)，慢慢發(fā)展到AML細(xì)胞中，所以于是對(duì)11個(gè)DNMT3A突變/NPM1c的AML個(gè)體中正常細(xì)胞（CD33-）進(jìn)行測(cè)序。

同時(shí)取了3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣本——初診、緩解和復(fù)發(fā)。

1. 關(guān)于流式分選策略：

CD33^- CD34⁺ CD45^dim CD38^- ：

• MLP：CD45RA⁺

• HSC：CD90⁺ CD45RA^-

• MPP：CD90^- CD45RA^-

CD33^- CD34⁺ CD45^dim CD38⁺ CD7^- CD10^- ：

• CMP：CD45RA^- CD135⁺

• MEP：CD45RA^- CD135^-

• GMP：CD45RA⁺ CD135⁺

2. 作者對(duì)上述分選出來(lái)的AML患者體內(nèi)正常HSPCs細(xì)胞和AML中blast細(xì)胞（CD33+ CD45^dim）進(jìn)行ddPCR對(duì)DNMT3A和NPM1c做定量檢測(cè)：

• 在所有AML患者的CD33⁺ blast細(xì)胞中，都發(fā)現(xiàn)了有DNMT3A突變和NPM1c。

• 沒(méi)有NPM1c，而只有DNMT3A突變的HSPCs和成熟細(xì)胞中VAF變化較大。

2. 上面的圖a和下圖b都是一個(gè)比較典型的患者數(shù)據(jù)——no.11號(hào)患者：

從圖a中可以得到的結(jié)論有（細(xì)胞數(shù)量差異）：

• 在不同時(shí)間點(diǎn)下細(xì)胞數(shù)組成差異較大，處于發(fā)病狀態(tài)下時(shí)，CD33^- CD34⁺ CD45^dim 細(xì)胞數(shù)減少，HSC細(xì)胞數(shù)減少。

• 如果把從初診→緩解→復(fù)發(fā)整個(gè)過(guò)程看作一個(gè)時(shí)間序列，那么：

• 細(xì)胞數(shù)一直增加的有：MLP、GMP

• 細(xì)胞數(shù)一直減少的有：MPP、CMP、MEP

從圖b中可以得到的結(jié)論有（克隆大小差異）：

• 在初診時(shí)，NPM1c克隆相對(duì)較小，只有GMP和Blast細(xì)胞中存在。在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移時(shí)，NPM1c克隆則在成熟和不成熟細(xì)胞中均有表達(dá)，且GMP中NPM1c克隆長(zhǎng)大了。

• 在緩解期間，NPM1c被全部清除。只有DNMT3A突變的存在。說(shuō)明DNMT3A突變克隆不是AML致病克隆。

• 不同時(shí)間點(diǎn)下：在HSC/MPP細(xì)胞中，僅帶有DNMT3A突變，而沒(méi)有NPM1c突變?？赡躈PM1c并不是來(lái)自HSC中，而是從下游的祖細(xì)胞而來(lái)。

• 復(fù)發(fā)的Blast細(xì)胞中DNMT3A的VAF變小，可能是因?yàn)橐坏┌l(fā)病后，DNMT3A就不再是主要的克隆，而慢慢減小。

1. 下面對(duì)11個(gè)個(gè)體中的突變情況進(jìn)行分析（不過(guò)文中沒(méi)有具體說(shuō)明這個(gè)樣本的時(shí)間點(diǎn)，但是根據(jù)b圖可以看出這個(gè)樣本應(yīng)該是在初診時(shí)采集的）：

• 不成熟的HSPCs（如HSC、MPP、CMP、MEP、MLP和GMP）都可以檢測(cè)到DNMT3A突變，而成熟細(xì)胞（如T、B和NK細(xì)胞）中很多沒(méi)有DNMT3A突變。這一點(diǎn)的話和疾病相關(guān)吧，因?yàn)?strong style="font-size: inherit;color: inherit;line-height: inherit;">AML就是分化阻滯嘛，即使不成熟細(xì)胞中帶有突變，在向下分化過(guò)程中肯定會(huì)有阻滯在某個(gè)階段，然后成熟細(xì)胞中就帶有較少的突變。

  這里作者說(shuō)這個(gè)證據(jù)可以說(shuō)明DNMT3A突變可以促進(jìn)AML中NPM1c的發(fā)生？？有點(diǎn)疑惑？？

• 有3個(gè)人的數(shù)據(jù)——10、16和14，他們?cè)?strong style="font-size: inherit;color: inherit;line-height: inherit;">HSC/MPP時(shí)沒(méi)有DNMT3A突變，而到了CMP時(shí)就有了DNMT3A突變，有2種解釋：1）因?yàn)镠SC/MPP時(shí)VAF比較低，檢測(cè)技術(shù)測(cè)不到。2）可能這個(gè)突變是在HSC/MPP→CMP過(guò)程中獲得的。

• 但是我發(fā)現(xiàn)有個(gè)患者非常奇怪——28號(hào)。HSC/MPP時(shí)就存在DNMT3A突變，到了CMP時(shí)卻沒(méi)有了？？到了MEP后又出現(xiàn)了，而且還是DNMT3A突變和NPM1c共存？？好像這個(gè)現(xiàn)象不局限于28號(hào)，在57、35、16、36、14中都有這個(gè)現(xiàn)象。

  有想法的同學(xué)歡迎來(lái)討論。

PART3-Pre-leukaemic HSCs可以耐受化療

1. 對(duì)下圖有個(gè)詳細(xì)的分析：

• 與初診時(shí)相比，在緩解和復(fù)發(fā)時(shí)，DNMT3A突變的VAF值略高或基本一致。

• 初診和復(fù)發(fā)時(shí)的CD33+的blast細(xì)胞會(huì)同時(shí)攜帶DNMT3A突變和NPM1c突變。而緩解期的CD33+細(xì)胞只有DNMT3A突變，說(shuō)明這些細(xì)胞不是AML細(xì)胞，而是僅僅攜帶有DNMT3A突變的干祖細(xì)胞（具有向下分化的能力）

• 在復(fù)發(fā)的樣本中，大多細(xì)胞類(lèi)型都具有2個(gè)突變，而只有HSC和MPP細(xì)胞只帶有DNMT3A突變。說(shuō)明HSC/MPP細(xì)胞并不是真正的AML細(xì)胞，在HSC/MPP→CMP/MLP過(guò)程中可能獲得新的突變，出現(xiàn)pre-leukaemic HSCs細(xì)胞。

1. no.57患者生存時(shí)間較長(zhǎng)，所以可以通過(guò)觀察這個(gè)樣本，比較早期緩解（3個(gè)月）和晚期緩解（36個(gè)月）時(shí)DNMT3A突變的情況：

• 可以看到相比于初診，在緩解期隨著時(shí)間的發(fā)展，DNMT3A的VAF值在大部分細(xì)胞中都是逐漸增大的，除了MEP、NK和T細(xì)胞基本不變。

1. 一些部分CD33+細(xì)胞，在緩解晚期（36個(gè)月）會(huì)出現(xiàn)類(lèi)似初診時(shí)同時(shí)攜帶DNMT3A突變和NPM1c的克隆，這說(shuō)明：

• 要么是初診時(shí)的造血克隆重新生長(zhǎng)起來(lái)

• 要么是pre-leukaemic HSCs中新獲得了NPM1c突變

小結(jié)：

因?yàn)樵诰徑夂蛷?fù)發(fā)過(guò)程中，DNMT3A突變一直存在，所以認(rèn)為Pre-leukaemic可以耐受化療。

PART4-Pre-leukaemic HSCs的克隆擴(kuò)增

為了檢驗(yàn)DNMT3A突變的HSC是否有功能上的改變，在重建時(shí)是否有優(yōu)勢(shì)，作者進(jìn)行了移植實(shí)驗(yàn)。

1. 實(shí)驗(yàn)樣本：

• 11號(hào)患者（HSC/MPP中DNMT3A的VAF=30%）和55號(hào)患者（HSC/MPP中DNMT3A的VAF=20%）中的外周血單個(gè)核細(xì)胞

• 極限稀釋LDA移植到免疫缺陷小鼠股骨內(nèi)

• 在移植后第8和16周流式分析檢測(cè)股骨內(nèi)的植入物細(xì)胞組成

• 白血病細(xì)胞植入物定義為：CD45^dim CD33⁺

• 非白血病細(xì)胞植入物的話是一個(gè)混合物，認(rèn)為既有淋系（CD19+B細(xì)胞），也有髓系細(xì)胞（CD33+）

其實(shí)這里我是有點(diǎn)疑問(wèn)的，為什么只CD33這個(gè)來(lái)分析，非常矛盾，我們一般認(rèn)為CD33是白血病細(xì)胞，正常髓系細(xì)胞的話可以用其他的marker吧？？

2. 對(duì)于no.11患者：

• 在35只小鼠中有24個(gè)長(zhǎng)出了非白血病細(xì)胞植入物，由此推斷干細(xì)胞的數(shù)目為每7.3*10⁵ 個(gè)細(xì)胞里有一個(gè)HSC。

1. no.11患者初診和復(fù)發(fā)樣本移植到小鼠16周時(shí)的數(shù)據(jù)結(jié)果：

• 初診時(shí)：有較多的CD19淋系細(xì)胞，而CD33的髓系細(xì)胞和白血病細(xì)胞相對(duì)少

• 復(fù)發(fā)時(shí)：全是CD33的髓系細(xì)胞和白血病細(xì)胞，而缺乏CD19淋系細(xì)胞

說(shuō)明與初診時(shí)相比，復(fù)發(fā)時(shí)LSC數(shù)目更多。

4. 又對(duì)于no.11患者比較不同植入物的組成以及VAF情況：

• 僅有DNMT3A突變的小鼠有9/12只，平均VAF=57%

• 同時(shí)有DNMT3A突變和NPM1c的有2只，其中12號(hào)的植入物中CD33細(xì)胞比例較高

• 只有一個(gè)植入物中超過(guò)50%的都是CD33+細(xì)胞（12號(hào)小鼠），植入物中DNMT3A和NPM1c的突變VAF都相對(duì)較高（是Blast細(xì)胞）。

1. 又做了一個(gè)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，分別檢測(cè)初診時(shí)外周血樣本，植入小鼠8周、16周后的植入物VAF：

關(guān)于這個(gè)圖如何看：

圖中第一列2個(gè)點(diǎn)分別是HSC和MPP中VAF的值

第二、三列中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)小鼠中植入物的VAF值

可以得到的結(jié)論：隨著時(shí)間的進(jìn)展，DNMT3A突變的VAF越來(lái)越高。

個(gè)人覺(jué)得以上描述非常的混亂，所以我就簡(jiǎn)單寫(xiě)下我自己的理解：

通過(guò)圖b，我們可以看到12號(hào)小鼠中，植入物數(shù)目是白血病blast細(xì)胞為主，而且突變信息驗(yàn)證了這一點(diǎn)。而3號(hào)小鼠中，植入物數(shù)目中白血病blast細(xì)胞相對(duì)于其他較多，但是突變信息中證實(shí)這些都是正常的細(xì)胞。

6. 上面的數(shù)據(jù)表明：

• HSC/MPP中發(fā)生DNMT3A突變可以向下繼續(xù)分化。所以認(rèn)為這樣的細(xì)胞就是所謂的pre-leukaemic HSCs

• DNMT3A突變可以帶給pre-leukaemic HSCs一定的造血重建優(yōu)勢(shì)。

• 小鼠移植模型說(shuō)明，當(dāng)pre-leukaemic HSCs數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于LSC時(shí)，會(huì)主要產(chǎn)生非白血病細(xì)胞植入物。

6. 接下來(lái)作者用自己手上有的264歷史臨床AML樣本移植到小鼠中的數(shù)據(jù)，總結(jié)了下移植物的細(xì)胞組成情況：

• 37%沒(méi)有植入物

• 40%是白血病植入物

• 23%是非白血病植入物

于是作者又找到了手上有的歷史數(shù)據(jù)——264個(gè)樣本中有25個(gè)患者有一代sanger測(cè)序數(shù)據(jù)：

使用一代sanger測(cè)序方法對(duì)25個(gè)樣本進(jìn)行分析植入物的情況：

• 10/25有DNMT3A突變

• 12/25有IDH1/IDH2突變（其中3個(gè)同時(shí)有DNMT3A突變）

因?yàn)檫@是歷史數(shù)據(jù)，所以沒(méi)法確定到底這些植入物的來(lái)源是pre-leukaemic HSCs還是LSC。

8. 前面證明了pre-leukaemic HSCs中是攜帶有DNMT3A的，那么pre-leukaemic HSCs會(huì)不會(huì)攜帶有IDH1/2呢？如果能證明pre-leukaemic HSCs中攜帶有IDH1/2也許也能說(shuō)明前面的問(wèn)題，這些植入物來(lái)源于pre-leukaemic HSCs。于是用ddPCR對(duì)52，64，77號(hào)患者初診時(shí)的樣本流式分選細(xì)胞分別進(jìn)行檢測(cè)NPM1c和IDH2的突變VAF：

• 在所有Blast細(xì)胞中可以看到同時(shí)具有IDH2和NPM1c的存在，而在其他正常細(xì)胞中只有IDH2突變的存在。由此推斷IDH2突變也是一個(gè)pre-leukaemic的狀態(tài)。

討論

1. 確定了在白血病的發(fā)生過(guò)程中，DNMT3A→NPM1c及FLT3突變的大致順序。

2. 確定了在診斷時(shí)pre-leukaemic HSCs的存在，并且如果基于他們的數(shù)據(jù)，大概有25%的AML患者中有DNMT3A突變的存在。

3. 確定了DNMT3A突變的HSC/MPP有重建的優(yōu)勢(shì)。

4. 因?yàn)樵诰徑夂蛷?fù)發(fā)過(guò)程中，DNMT3A突變一直存在，所以認(rèn)為Pre-leukaemic可以耐受化療，目前一些針對(duì)Pre-leukaemic突變的藥物如IDH抑制劑之類(lèi)的，也許可以在他們產(chǎn)生更強(qiáng)耐藥性前徹底清除這些克隆。

后記

老實(shí)說(shuō)，看Shlush的文章真的讓人焦頭爛額，可能還是自己沒(méi)能達(dá)到那個(gè)層次吧，先這樣吧??