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前言背景知識關(guān)于ATAC-seq發(fā)展現(xiàn)狀關(guān)于染色質(zhì)可及性測序的方法小結(jié)MNase-seqDNase-seqFAIRE-seqATAC-seq小結(jié)關(guān)于Tn5轉(zhuǎn)座酶原理ChIP-seq中陰性對照的設(shè)置pioneer factor關(guān)于ATAC-seq數(shù)據(jù)分析shift-extend方法預(yù)測peaks的原理第一部分——pre-analysis比對前質(zhì)控比對比對后質(zhì)控小結(jié)第二部分——peak calling小結(jié)第三部分——高級分析PeaksPeak differential analysisPeak annotationMotifsMotif database and scanMotif enrichment and activity analysisFootprintsDe novo toolsMotif-centric tools對于footprint分析的評價Nucleosome positioning第四部分——多組學(xué)數(shù)據(jù)聯(lián)合分析建立調(diào)控網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)與ChIP-seq聯(lián)合分析與RNA-seq聯(lián)合分析建立調(diào)控網(wǎng)絡(luò)未來展望和總結(jié)生信教程補(bǔ)充后記
前言
今天分享一篇文獻(xiàn)，主要介紹ATAC-seq中的一些主要問題。
文獻(xiàn)標(biāo)題：From reads to insight: a hitchhikers guide to atAC-seq data analysis
文獻(xiàn)地址：https://genomebiology./articles/10.1186/s13059-020-1929-3
下載地址：https://genomebiology./track/pdf/10.1186/s13059-020-1929-3
在閱讀這篇文章的過程中，前面因為我自己跑過流程，所以看起來還是比較輕松，但是到了后面的高級分析部分，就有些難度了，很多之前模模糊糊的地方都要再去查找文獻(xiàn)去找到答案，這里放一個我覺得收獲許多背景知識的中文博士論文：
ATAC-seq數(shù)據(jù)分析軟件開發(fā)及其在肥胖誘導(dǎo)的慢性炎癥研究中的應(yīng)用，作者：左祖奇
因為在知網(wǎng)可以下載，但是沒有賬號你們可能還是沒法下載，所以我把它也放到了百度網(wǎng)盤里，有需要的在公眾號回復(fù) “ATAC” 拿到我下好的pdf文件吧。
背景知識
關(guān)于ATAC-seq發(fā)展現(xiàn)狀
DNA序列包裝成核小體→染色質(zhì)→染色體
因為人體基因組是高度壓縮狀態(tài)，而轉(zhuǎn)錄和翻譯都是需要在松散結(jié)構(gòu)下的染色質(zhì)情況下才可以進(jìn)行，所以認(rèn)為染色質(zhì)的開放程度和基因轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)。
關(guān)于ATAC-seq的原理，我之前寫過推文介紹：
CHIP-seq 2013年Greenleaf的第一篇文章
不過又來又學(xué)到了更多知識，只不過一直沒有補(bǔ)充進(jìn)入，今天發(fā)現(xiàn)了一個寫的還不錯的推文，在這里推薦給大家去學(xué)習(xí)相關(guān)的基礎(chǔ)知識：
ChIP-seq和ATAC-seq基礎(chǔ)知識（視頻）
近些年來ATAC-seq技術(shù)的發(fā)展非常的迅速，從2013年greenleaf發(fā)表的第一篇關(guān)于ATAC-seq的文章后，這項技術(shù)迅速得到大家的喜愛：
包括在去年，greenleaf與10xGenomics公司和做，開發(fā)了10XscATAC-seq的測序方法，各種新技術(shù)層出不窮。
但是針對ATAC-seq的數(shù)據(jù)分析工具不多，因為ChIP-seq數(shù)據(jù)和ATAC-seq數(shù)據(jù)的相似性，目前主要使用的都是以前開發(fā)用于ChIP-seq的工具，默認(rèn)為這兩種數(shù)據(jù)分布結(jié)構(gòu)是相似的，但是并沒有人真正系統(tǒng)地去評估這兩種數(shù)據(jù)分布。
今天分享的這篇綜述主要是介紹在ATAC-seq分析過程中的一些思路和套路流程。主要包括4個方面：
關(guān)于染色質(zhì)可及性測序的方法小結(jié)
目前用于研究染色質(zhì)可及性的方法主要有以下四種：MNase-seq、DNase-seq、FAIRE-seq和ATAC-seq：MNase-seq是通過對核小體保護(hù)的DNA片段測序，從而間接反映染色質(zhì)可及性的方法，其他三種均為對檢測染色質(zhì)上的開放區(qū)域測序，直接反映染色質(zhì)的可及性。
MNase-seq
微球菌核酸酶（ Micrococcal nuclease， MNase）是來源于金黃色葡萄球菌分泌的一種核酸酶，同時具備核酸內(nèi)切酶和外切酶的活性。MNase優(yōu)先對裸露的DNA或核小體之間起連接作用的DNA進(jìn)行切割和消化。所以這種方法一般用于檢測開放區(qū)域。
標(biāo)準(zhǔn)的 MNase-seq的流程主要用于對核小體片段（~150bp）或更長的片段進(jìn)行測序。
DNase-seq
脫氧核糖核酸酶I（ DNase I）是由人的基因 DNASEI編碼的核酸內(nèi)切酶，可以非特異性的對雙鏈DNA進(jìn)行切割。但是沒有外切酶活性。
在基因組學(xué)和染色質(zhì)的研究中DNase I敏感的位點被認(rèn)為是開放的，可接近的染色質(zhì)的特征。低濃度的 DNase i對基因組上非核小體占據(jù)的的開放區(qū)域進(jìn)行切割，這些區(qū)域被稱為DNase I敏感位點（ DNase I hypersensitive sites，DHSs）。
DNase-seq目前已成為檢測染色質(zhì)可及性的“金標(biāo)準(zhǔn)”。
DHSs中序列特異性的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合也會阻止 DNase I對DNA的切割，從而可以在單個堿基水平觀察到轉(zhuǎn)錄因子的占據(jù)情況，即轉(zhuǎn)錄因子的印跡分析（footprint）。轉(zhuǎn)錄因子的印跡分析已被用于發(fā)掘人類細(xì)胞中細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的“基序”（motif），并揭示了轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)和細(xì)胞分化的相關(guān)性。
FAIRE-seq
甲醛輔助的調(diào)控元件的分離（ Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements，F(xiàn)ARE）是一種直接檢測無核小體占據(jù)的DNA序列的方法。其原理是，纏繞有DNA的核小體和無核小體結(jié)合的DNA，在苯酚和氯仿中的溶解度不同，因而在苯酚和氯仿形成的兩相液體中呈現(xiàn)差異分布：纏繞有DNA的核小體分布于兩相界面處，而無核小體結(jié)合的DNA分布于親水相中。
具體的實驗流程包括：
使用甲醛對染色質(zhì)進(jìn)行交聯(lián)以便鞏固蛋白質(zhì)-DNA的結(jié)合。
通過超聲處理，打斷染色質(zhì)，形成DNA片段或者DNA-核小體復(fù)合物。
通過苯酚-氯仿抽提純化無核小體結(jié)合的DNA片段。
建庫測序
FAIRE直接富集了活化染色質(zhì)的區(qū)域，同時無核小體占據(jù)的區(qū)域并沒有被酶解。
ATAC-seq
該方法已被用于真核生物細(xì)胞全基因組范圍內(nèi)的：
開放染色體區(qū)域檢測
核小體位置確定
轉(zhuǎn)錄因子的印跡描繪
ATAC-seq建庫過程簡單快捷，只需要兩步操作，同時僅需要較少的細(xì)胞數(shù)目，而且可以在很高的分辨率下揭示染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)。
ATAC-seq僅僅使用500到50000個細(xì)胞就可以實現(xiàn)與 DNase-seq使用百萬數(shù)量級的細(xì)胞才能達(dá)到的靈敏度和特異性。
ATAC-seq目前亟待解決的問題是對測序數(shù)據(jù)分析，原有的分析方法不適用于ATAC-seq的數(shù)據(jù)分析或僅可以有限度的使用。
小結(jié)
關(guān)于Tn5轉(zhuǎn)座酶原理
http://www./sub/showarticle.asp?newsid=72268
Tn5轉(zhuǎn)座子是一種細(xì)菌轉(zhuǎn)座子，最早由E. coli中發(fā)現(xiàn)，是一段含有若干抗性基因和編碼轉(zhuǎn)座酶基因的DNA片段。
其中IS50R和IS50L的序列高度同源，只是IS50L的一個堿基存在突變。
IS50具有19bp的倒置末端（外末端outside end，OE和內(nèi)末端inside end，IE），兩末端倒置有7個堿基不同。此倒置末端是轉(zhuǎn)座酶（Tnp）的作用位點。
IS50L和IS50R均含有編碼轉(zhuǎn)座酶（TnP）以及轉(zhuǎn)座阻遏蛋白（lnh）的基因，但由于IS50L中的堿基突變，造成翻譯提前終止，所以僅有IS50R可以產(chǎn)生正常的有活性的TnP和lnh。
兩個轉(zhuǎn)座酶（Tnp）分子結(jié)合到Tn5轉(zhuǎn)座子的OE末端，形成兩個Tnp-OE復(fù)合體，隨后兩個復(fù)合體通過Tnp的C末端相互作用進(jìn)行聯(lián)會，形成一個Tn5轉(zhuǎn)座復(fù)合體，此時Tnp產(chǎn)生切割DNA的活性。
隨后Tnp利用切割活性，經(jīng)過一系列化學(xué)反應(yīng)切除供體DNA，離開供體鏈。
結(jié)合到靶DNA上時，Tn5轉(zhuǎn)座復(fù)合體識別并攻擊靶序列（Target site），將轉(zhuǎn)座子插入到靶序列中，粘性末端通過DNA聚合酶、連接酶作用進(jìn)行填補(bǔ)，兩端形成9bp正向重復(fù)序列。整個轉(zhuǎn)座過程完成了基因從原始DNA被剪切之后粘貼在另一受體DNA的過程，實現(xiàn)了基因的“跳躍”。
（解釋1）
（解釋2）
根據(jù)之前的報道，Tn5轉(zhuǎn)座酶以同源二聚體的形式結(jié)合到DNA上，在兩個Tn5分子間隔著9-bp的DNA序列。根據(jù)這個情況，每個Tn5同源二聚體的結(jié)合事件會產(chǎn)生2個「Insertions」，中間隔著9bp。因此，真實的"開放"位置的中心在Tn5二聚體的正中間，而不是Tn5的插入位置。為了盡可能的還原真實情況，我們對Tn5的「Insertions」進(jìn)行了校正，即正鏈的插入結(jié)果往右移動4bp(+4 bp), 負(fù)鏈的插入結(jié)果往左偏移5bp(-5 bp)。
ChIP-seq中陰性對照的設(shè)置
推薦看一篇推文：
ChIP-seq的實驗對照與偏差來源
簡單歸納后要點如下：
為什么需要設(shè)置陰性對照：
因為超聲破碎過程中DNA的斷裂不均一，尤其是一些開放染色質(zhì)區(qū)域在超聲樣本中優(yōu)先累積，未經(jīng)過IP的樣本超聲破碎后會產(chǎn)生數(shù)量不小的peaks。
可以有去除背景噪音的作用（排除因本身表達(dá)水平高或一些非特異性結(jié)合所造成的假陽性peaks）。
還可以根據(jù)Input中的靶序列的含量以及染色質(zhì)沉淀中的靶序列的含量，按照取樣比例換算出ChIP的效率（如果用同一引物進(jìn)行PCR，ChIP組和input組亮度差不多，說明ChIP效率高，樣本中所有的目的基因片段都被ChIP下來了）。
如何設(shè)置對照：
pioneer factor
pioneer factor，先驅(qū)轉(zhuǎn)錄因子，是一種特殊的TF，可以結(jié)合在核小體DNA上，直接介導(dǎo)染色質(zhì)可及性的改變。
關(guān)于ATAC-seq數(shù)據(jù)分析
有幾點是我之前沒有太注意到的，這里標(biāo)注下。
ATAC-seq數(shù)據(jù)中包括了開放染色體區(qū)域檢測（call peaks），核小體位置的檢測以及轉(zhuǎn)錄因子的印跡（footprints）的分析。
由于真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄起始位點被報道處于開放狀態(tài)，因而可將TSS信號的強(qiáng)度作為檢測 DNase-seq和ATAC-seq信噪比的標(biāo)準(zhǔn)，同時，在全基因組范圍內(nèi)，DNase-seq和ATAC-seq的所獲得的片段長度分布，應(yīng)可以見明顯的核小體占據(jù)“峰”。
由于其建庫過程中，可能引入線粒體DNA，因此需要檢測其中線粒體DNA的比例。
染色質(zhì)可及性分析的首要目的是尋找到基因組上的開放區(qū)域。所謂信號峰搜尋（call peaks），就是在全基因組范圍內(nèi)找出測序讀長累積形成的脈沖峰的位置及信號強(qiáng)度。這些峰的位置代表了基因組上的開放區(qū)域，峰的髙度或面積代表了該區(qū)域的開放程度。同時，由于這些區(qū)域與基因的表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)，他們與各自附近的基因在基因組上的位置關(guān)系和功能注釋也值得關(guān)注。
信號峰的搜尋一般會產(chǎn)生存儲有信號峰位置信息的BED格式的文件。對信峰上信號強(qiáng)度統(tǒng)計，可以獲得每個開放區(qū)域的可及性。在具體的生物學(xué)比較分析中，研究者可通過比較不同組別之間信號峰的強(qiáng)度差異，或?qū)Σ町愋盘栠M(jìn)行聚類分析，篩選出感興趣的開放區(qū)域。
染色質(zhì)上的開放位點意味著沒有核小體的占據(jù)，這些區(qū)域里往往包含大量的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，也對結(jié)合區(qū)域提供了保護(hù)，避免了被 DNase或Tn5酶的剪切。轉(zhuǎn)錄因子在DNA上的結(jié)合區(qū)域很短，一般為8-30bp長，相比于結(jié)合區(qū)域周圍，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域酶切的信號強(qiáng)度往往更弱，統(tǒng)計結(jié)合區(qū)域及附近區(qū)域遂個堿基上的酶切信號強(qiáng)度可以看到結(jié)合區(qū)域呈現(xiàn)明顯的凹陷，該凹陷指示該轉(zhuǎn)錄因子在該區(qū)域的確發(fā)生了結(jié)合。染色質(zhì)可及性分析的目的之一就是找到在開放區(qū)域上富集有哪些轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，以及描述這些位點上轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合情況。
根據(jù)算法的不同，轉(zhuǎn)錄因子富集分析的方法主要有兩大類：
對已知轉(zhuǎn)錄因子的搜尋，依賴于已知的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的位點信息，這些住息來源于前人對轉(zhuǎn)錄因子所做的ChP-seq分析，且往往以位置權(quán)重矩陣position weight matrices，pwMs）的形式存儲。專門存儲轉(zhuǎn)錄因子PwMS的數(shù)據(jù)庫主要有 MatBase， JASPAR， TRANSFAC和 UniPROBE。
shift-extend方法預(yù)測peaks的原理
文中提到了一個shift-extend方法來預(yù)測peaks，于是我找了很多資料，最后終于找到了一個不錯的解釋：
ChIP-seq 分析------原理：https://www.jianshu.com/p/dc493cb7b1b3
對于一個DNA序列來說（有正負(fù)鏈的），它mapping的位置正負(fù)鏈都有的，對這些reads位置進(jìn)行統(tǒng)計畫圖可以看到一個紅色的peak，一個藍(lán)色的peak。這兩個peak說明的是一個事情，就是這個地方有富集。最后對這兩個peak進(jìn)行merge，最后變成了一個富集區(qū)域。灰色的peak!
所謂的shift-extend，就是把PE測序片段進(jìn)行延伸，然后這樣就可以直接得到灰色的覆蓋區(qū)域最多，peaks也就最高了。
通過看圖示，發(fā)現(xiàn)具體過程如下：
先將片段向外移動s個單位，然后再向內(nèi)延伸2s個單位。
第一部分——pre-analysis
比對前質(zhì)控
這個是所有測序技術(shù)都需要進(jìn)行的QC流程，主要是看看接頭有沒有去除干凈，GC比例是否合格，測序質(zhì)量情況如何等等，可以使用linux平臺的工具如：FastQC
測序文件在5'開始時和3'端結(jié)束前，測序質(zhì)量可能會有一個大幅降低，這個是可以接受的，原因和測序中酶活性以及機(jī)器設(shè)計原理相關(guān)。
比對
一般在我們運行完去除接頭這些比對前質(zhì)控操作后，一般會再運行一次FastQC來查看質(zhì)控效果。
然后就對通過質(zhì)控fastq文件進(jìn)行mapping。一般使用BWA或者Bowtie2工具。
對于比對完成的bam文件我們可以使用samtools或者經(jīng)典的Picard工具來分析下比對后的情況，文獻(xiàn)這里建議：
比對后質(zhì)控
做完比對后，我們?nèi)匀恍枰鲑|(zhì)控，從unique mapping reads/rates，duplicated read percentages，fragment size distribution等等方面去評估。
如果遇到下面的情況，則reads需要被去除：
上述的質(zhì)控可以提高數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，降低假陽性率。
但是，上述的可能并不是ATAC-seq質(zhì)控的特異指標(biāo)，因為我們在做RNA-seq或者ChIP-seq數(shù)據(jù)分析中也會做這些質(zhì)控，下面有幾個ATAC-seq質(zhì)控的特異指標(biāo)：
片段長度分布圖如下：
這個圖如何看可以看我之前寫的推文：
CHIP-seq 2013年Greenleaf的第一篇文章
如下：
上述這種評估可以使用ATACseqQC工具進(jìn)行評估。
還有一個比較容易忽視的細(xì)節(jié)，也是比較重要的，根據(jù)一個朋友的經(jīng)驗，他提醒我關(guān)于reads需要移動的一個tips——"+4和-5"規(guī)則：
小結(jié)
作者提供了他們自己分析所使用到的工具pipeline：
FastQC? trimmomatic?BWA-MEM?ATACseqQC
第二部分——peak calling
目前存在的一些用于peak calling的工具以及他們背后用到的統(tǒng)計學(xué)分布總結(jié)：
一般call peaks都是使用MACS2工具，在ENCODE官網(wǎng)上的ATAC-seq的pipeline上也推薦使用MACS2來call peaks。
目前存在的call peaks工具99%都是和ChIP-seq分析混用的，只有一個工具是專門針對ATAC-seq數(shù)據(jù)而開發(fā)的——HMMRATAC。
我們知道，在做ChIP-seq時，需要有正常input control對照。但是在ATAC-seq中一般不設(shè)置input control對照。
對于ATAC-seq的PE數(shù)據(jù)，在經(jīng)過比對后，得到的范圍涉及到了NFR和核小體結(jié)合區(qū)：
而對于所謂的開放區(qū)，其實是來自NFR區(qū)域的比對結(jié)果的，或者使用一種生信方法——shift-extend。
目前call peaks的工具大致分為2大類：①基于計數(shù) ②基于分析形狀
基于計數(shù)的call peaks使用不同的統(tǒng)計方法來比較某個特定區(qū)域內(nèi)的reads分布和隨機(jī)情況下的reads分布形狀。如MACS2、HOMER、SICER/epic2都是假設(shè)是泊松分布；而ZINBA則假定是零膨脹負(fù)二項分布；等等。
因為F-seq和ZINBA 并不是經(jīng)常有人維護(hù)，所以作者不建議使用。
總的來說，基于計數(shù)的call peaks使用更多，更容易解釋。
基于分析形狀的call peaks不常使用。
HMMRATAC是唯一一個專門針對ATAC-seq的call peaks工具。優(yōu)點在于：結(jié)果比MACS2和Fseq等工具找到更好，并且可以同時提供給我們核小體的位置信息。缺點在于：計算量非常大，用到很多機(jī)器學(xué)習(xí)方面的算法，如三態(tài)半監(jiān)督隱馬爾可夫模型（一聽就很厲害，讓人不想去看，哈哈哈哈哈哈）
關(guān)于實驗中的設(shè)置生物學(xué)重復(fù)問題：設(shè)置生物學(xué)重復(fù)可以減低假陽性，同時提高可重復(fù)性。大多數(shù)工具在使用時都可以通過參數(shù)設(shè)置處理生物學(xué)重復(fù)。
放一個真實數(shù)據(jù)的ATAC-seq圖：
分成3大部分：HMM based工具、count-based工具以及shape-based工具。
RUNX1 motif track：是從JASPAR公共數(shù)據(jù)庫里得到的RUNX1 footprint結(jié)果
K562 ChIP-seq track ：是從ENCODE公共數(shù)據(jù)庫里得到的RUNX1的ChIP-seq結(jié)果。（相當(dāng)于是一個標(biāo)準(zhǔn)答案，因為是直接用ChIP拉下來的片段）
小結(jié)
目前沒有工作去比較ATAC-seq中peak calling的表現(xiàn)性能，作者推薦使用MACS2和HOMER這種工具來peak calling，如果服務(wù)器足夠強(qiáng)大，就推薦使用HMMRATAC去call peaks。
第三部分——高級分析
Peaks
Peak differential analysis
目前存在的一些Peak differential analysis的工具總結(jié)：
目前沒有專門針對ATAC-seq數(shù)據(jù)找差異peaks的工具。
目前存在的工具一般分成2種：
consensus peak是指：不同生物學(xué)樣本重復(fù)得到的peaks進(jìn)行合并后，找到的一些所有重復(fù)樣本中都存在的peaks。這樣可以減少假陽性結(jié)果。HOMER默認(rèn)會用將所有樣本的peaks混合pool在一起后算出consensus peak。而DBChIP，DiffBind則通過在不同樣本之間取交集來得到consensus peak。
Sliding window-based工具：使用這種方法的話，無須去生成consensus peak，他們會評估所有全基因組上每個bin區(qū)域，這樣當(dāng)然會有更多的假陽性情況，于是需要做FDR進(jìn)行校正p值。
獨立工具有：PePr和DiffReps，他們使用負(fù)二項分布檢驗、G檢驗或卡方檢驗。ChIPDiff則應(yīng)用HMM去計算2個臨近窗口的相關(guān)性。
還有些工具，如csaw，則是依賴于其他的DE分析的R包edgeR。
Sliding window-based工具因為是對整個基因組范圍進(jìn)行分析，所以是一種unbiased的方法，但是這也提示，使用這種方法進(jìn)行分析時，需要一個很嚴(yán)格的過濾標(biāo)準(zhǔn)！
目前絕大多數(shù)的研究都證實ATAC-seq數(shù)據(jù)中reads的分布符合泊松分布，這和RNA-seq數(shù)據(jù)的分布是一致的。
shape-based的差異peaks分析工具沒有專門針對ATAC-seq數(shù)據(jù)的，但是因為shape-based的方法可以用到同一個數(shù)據(jù)的2個維度——reads+分布形狀，所以作者認(rèn)為這種方法應(yīng)該會給我們提供更多的信息。并且作者推薦使用csaw，因為這個工具核心是依賴于edgeR，這樣結(jié)果更好解釋。
Peak annotation
使用工具：HOMER，ChIPseeker和ChIPpeakAnno使用最多。
一般對于peaks的注釋，都是找離peaks距離最近的gene（內(nèi)含子或外顯子）或者調(diào)節(jié)元件（promoter，5′ UTR，3′ UTR等）。
簡單來說，就是exon與intron是互斥的，exon包含UTR和CDS。具體的關(guān)系可以看我之前分析CCDS文件的系列過程：
探索hg19中基因exon坐標(biāo)問題
再次探索hg19中基因exon坐標(biāo)問題
探索CCDS文件
一般來說生信分析的軟件，對于peaks注釋后的可視化展示最經(jīng)典的如下餅圖：
代碼的話其實直接用Y叔的R包就可以了，非常的簡單，有空了把相關(guān)畫圖代碼找找放上來吧~
得到這些注釋結(jié)果后，可以通過GO/KEGG/Reactome等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行富集分析，其實代碼也非常的簡單。日后用到再整理吧~
Motifs
所謂的Motifs就是那些可以結(jié)合TF的DNA序列，而TF結(jié)合的位置稱為TFBS（TF binding sites）。TF如果想要對轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控，就必須和DNA上的順式作用元件結(jié)合，而TF結(jié)合的前提通常來說是這段DNA序列是可接近的，也就是ATAC-seq中可以測到。不過也有少數(shù)TF可以和那些非開放區(qū)域進(jìn)行結(jié)合。
TF調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的機(jī)制：1）競爭組蛋?或?組蛋?；2）co-factor互作
具體介紹TF調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄機(jī)制的綜述推薦：
文章地址：https://www./articles/s41576-018-0089-8
下載地址：https://www./articles/s41576-018-0089-8.pdf
Motif database and scan
和其他的生信分析思路類似，想要探索Motifs的信息，我們需要先有一個Motifs的數(shù)據(jù)庫，例如：
JASPAR（包括多個物種，可以通過API進(jìn)行訪問、存在Bioconductor的R包）
CIS-BP和TRANSFAC（真核生物）
HOCOMOCO（人和鼠的數(shù)據(jù)）
RegulonDB（大腸桿菌數(shù)據(jù)庫）
HOMER（Linux）以及Bioconductor上的一些R包（TFBSTools和motifmatchr）都可以通過檢索給定的DNA序列來判斷TFBSs。
PWMScan可以直接在線使用，需要提供bowtie index后的文件。
MEME工具（之前使用過）包括幾個組件組成，其中：
FIMO去搜索Motif
MAST合并多個Motif
MCAST推斷調(diào)節(jié)模塊
推薦使用的工具——MEME和PWMScan
Motif enrichment and activity analysis
前面的工具，找到了Motif的位置和發(fā)生頻率，接下來就看這些Motif在peaks里的頻率了。HOMER用到的統(tǒng)計學(xué)原理是超幾何檢驗，這個比較好理解，不懂的可以去看我之前寫過關(guān)于超幾何檢驗的推文。MEME-AME則用到的是秩和檢驗 。DAStk通過計算MD分?jǐn)?shù)來判斷。當(dāng)然還有更多其他的方法，不過這些方法都是通過應(yīng)用不同的統(tǒng)計學(xué)方法來比較Motif在peaks中的頻率，從而得到真正的Motif吧。
通過計數(shù)fragments的讀數(shù)，可以得到TFBS的可及性，這個和TF的活性相關(guān)。而ChromVAR工具就是針對scATAC-seq數(shù)據(jù)而設(shè)計的，但是是否可以 應(yīng)用于bulk ATAC-seq數(shù)據(jù)目前沒有研究。DiffTF則針對所有TFBS計算一個可及性改變FC
這里提到的所有工具都是用來間接預(yù)測peaks區(qū)域內(nèi)的TFBSs。但是這里找到的TFBSs可能有一些是錯誤的。因為目前并不是所有的TF都有明確的Motif序列，而且，來自相同家族的TF可以有共同的Motif結(jié)合序列。
Footprints
我們解析TF調(diào)節(jié)也可以用Footprints。所謂的Footprints是指：激活的TF結(jié)合的DNA序列，這段序列因為和TF結(jié)合而不受Tn5酶切處理。
使用Footprints進(jìn)行分析存在的幾個要點：
前面提到關(guān)于read的移動，需要正鏈的插入結(jié)果往右移動4bp(+4 bp), 負(fù)鏈的插入結(jié)果往左偏移5bp(-5 bp)。
因為Tn5酶具有偏好性，所以對于一些短暫結(jié)合的TF，F(xiàn)ootprints的檢測存在困難。在過去用DNase-seq時這種困難也存在。
分析Footprints的工具主要分成2大類：
de novo：根據(jù)Footprints的典型特征，預(yù)測所有peaks區(qū)域的Footprints，得到的結(jié)果和已知的Motif去做匹配，少數(shù)無法匹配到的則為新發(fā)現(xiàn)的Motif。
motif-centric：需要我們提供一個TFBSs的信息文件，并通過機(jī)器學(xué)習(xí)的思想去區(qū)分這些屬于結(jié)合狀態(tài)和非結(jié)合狀態(tài)。
De novo tools
這種方法的一個重點在于要用數(shù)學(xué)方法上去定義什么是一個footprint，并且盡量降低由于Tn5酶切偏好性引起的footprint噪音。
這里列舉HINT-ATAC工具，使用隱馬爾科夫模型（HMM），同時矯正了Tn5酶切偏好性：
對于使用HMM的工具，本質(zhì)上都是需要監(jiān)督學(xué)習(xí)的，所以也就是說，需要我們手動去注釋一些基因區(qū)域，因此這類工具在更大范圍內(nèi)的使用問題仍需測評。
Motif-centric tools
利用非監(jiān)督學(xué)習(xí)的方法進(jìn)行聚類，基于一系列參數(shù)如：距離TSS距離，PWM分?jǐn)?shù)，reads分布，reads數(shù)目等等將可能的TFBSs分成結(jié)合狀態(tài)和非結(jié)合狀態(tài)。CENTIPEDE工具對于參數(shù)的變化比較敏感；msCentipde可以提高低深度和低質(zhì)量數(shù)據(jù)的表現(xiàn)；PIQ在有生物重復(fù)的情況下可以提高結(jié)果的魯棒性。
利用監(jiān)督學(xué)習(xí)的方法進(jìn)行聚類，基于高質(zhì)量的ChIP-seq數(shù)據(jù)來注釋真正的TFBSs。MILLIPEDE和BinDNase使用邏輯回歸，DeFCoM使用支持向量機(jī)SVM，BPAC使用隨機(jī)森林進(jìn)行鑒定。
對于footprint分析的評價
一般來說，監(jiān)督學(xué)習(xí)工具會比非監(jiān)督學(xué)習(xí)工具和de novo工具效果更好，但是其通用性就稍遜一籌。
偏差校正在DNase-seq和ATAC-seq足跡檢測中都很重要。
能夠有效實現(xiàn)足跡分析的ATAC-seq最小測序深度是多少，目前沒有標(biāo)準(zhǔn)。雖然建議每個樣品read數(shù)超過2億，但有報道稱DeFCoM對于更少的測序read數(shù)也能有不粗的表現(xiàn)。
對于低質(zhì)量和之前未報道過的motif，de novo方法仍然具有優(yōu)勢。
作者認(rèn)為HINT-ATAC可以是一個不錯的選擇，因為它具有ATAC-seq特異性的偏好校正。
同樣的，研究人員可以結(jié)合多種工具的結(jié)果來獲得高度可靠的足跡。
Nucleosome positioning
在ATAC-seq數(shù)據(jù)中，較長的reads片段對應(yīng)著開放區(qū)中纏繞核小體的DNA片段。有許多工具用來分析檢測這些纏繞核小體的DNA序列，但是根據(jù)研究證明，由于ATAC-seq數(shù)據(jù)中這些區(qū)域的覆蓋深度較淺，所以相比與MNase-seq數(shù)據(jù)來說，分析更加困難。
針對MNase-seq開發(fā)的軟件如DANPOS2，PuFFIN，INPS，和NucTools，可以在ATAC-seq數(shù)據(jù)過濾得到核小體相關(guān)片段后使用，而NucleoATAC和HMMRATAC是專為ATAC-seq開發(fā)的。
所有這些工具都具有典型ATAC-seq實驗的相同潛在缺點，即染色質(zhì)開放區(qū)之外的覆蓋率較低。期待未來開發(fā)用于ATAC-seq的生物信息學(xué)方法，以更有效和精確地捕獲核小體的占位。目前作者認(rèn)為HMMRATAC和NucleoATAC是用于ATAC-seq核小體檢測的兩個有用且特異性的工具。
第四部分——多組學(xué)數(shù)據(jù)聯(lián)合分析建立調(diào)控網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)
與ChIP-seq聯(lián)合分析
由于開放染色質(zhì)是大多數(shù)TF結(jié)合的前提條件，但是不是所有開放染色質(zhì)都有TF的結(jié)合，因此ATAC-seq峰通常與TF ChIP-seq峰重疊，但通常更寬。聯(lián)合TF ChIP-seq和ATAC-seq可以相互驗證彼此的質(zhì)量和可靠性。
ChIP-seq中存在TF的峰，而在ATAC-seq中不存在，可能指示了先驅(qū)轉(zhuǎn)錄因子（pioneer factor），它結(jié)合到封閉染色質(zhì)，然后招募染色質(zhì)重塑因子或其他轉(zhuǎn)錄因子并起始轉(zhuǎn)錄。
ATAC-seq也可以與標(biāo)記組蛋白修飾的ChIP-seq聯(lián)合分析，驗證與活躍染色質(zhì)標(biāo)記（如H3K4me3的，H3K4me1，H3K27ac等）正相關(guān)，與不活躍的染色質(zhì)標(biāo)記（如H3K27me3）負(fù)相關(guān) 。
由于ATAC-seq實驗方法的\簡便性和樣品需求較少，因此可以在做ChIP-seq實驗之前，把ATAC-seq當(dāng)成一種預(yù)實驗。
與RNA-seq聯(lián)合分析
我們可以驗證差異基因在各自的TSS周圍是否也具有明顯的染色質(zhì)可及性差異，從而從染色質(zhì)可及性的角度驗證自己的理論假說。
可以推定差異基因受到開放染色質(zhì)中特定TF的調(diào)控。
建立調(diào)控網(wǎng)絡(luò)
關(guān)于增強(qiáng)子的作用機(jī)理：
可以看到，啟動子promoter一般在target gene的上游，而Enhancer的話可以在gene的上/下游，或者在更遠(yuǎn)的位置。發(fā)揮作用時，只需增強(qiáng)子和TF結(jié)合后，通過增強(qiáng)TF的活性，促進(jìn)Promoter的轉(zhuǎn)錄活性。
增強(qiáng)子在線性基因組中可能非常遙遠(yuǎn)，但在空間上接近其目標(biāo)基因。這導(dǎo)致增強(qiáng)子的直接靶基因難以預(yù)測，因為很多研究都是直接把遠(yuǎn)端增強(qiáng)子聯(lián)系到最近的基因上，而非真正的target gene。
對于scATAC-seq，Pliner等人推出了Cicero，可將增強(qiáng)子和啟動子聯(lián)系到同一靶基因。盡管已證明Cicero可以用于scATAC-seq，但是沒有證據(jù)證明Cicero否適用于樣本量小的bulk ATAC-seq數(shù)據(jù)。
未來展望和總結(jié)
ATAC-seq近年來發(fā)展迅速，在實驗protocol取得了較大的進(jìn)展，但生物信息學(xué)分析工具的進(jìn)展緩慢，沒有成熟的分析pipeline。
在整個分析過程中，比對到參考基因組和質(zhì)控步驟與RNA-seq和ChIP-seq中類似。至于call peak，大多數(shù)ChIP-seq的工具都與ATAC-seq數(shù)據(jù)兼容，ATAC-seq特異性的call peak工具較少。
對于下游分析，peak差異分析可以概述染色質(zhì)可及性的變化。為了推斷生物學(xué)功能和相關(guān)的TF，peak注釋和motif富集分析是初步了解的首選。
motif和footprint分別是調(diào)控事件的直接和間接指標(biāo)。檢測footprint的困難來自酶切偏倚和TF結(jié)合DNA時間短引起的信號微弱。
由于ATAC-seq數(shù)據(jù)固有的弱點（峰以外的區(qū)域read覆蓋率很低），核小體檢測仍然很困難。
作者建議的分析流程：
用FastQC，trimmomatic和BWA-MEM進(jìn)行預(yù)分析
用MACS2進(jìn)行peak calling
使用csaw進(jìn)行peak差異分析
使用MEME進(jìn)行motif檢測和富集
使用ChIPseeker進(jìn)行注釋和可視化
使用HMMRATAC進(jìn)行核小體檢測
使用HINT-ATAC進(jìn)行足跡分析
如果同時有RNA-seq數(shù)據(jù)，則可以使用PECA方法重建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
生信教程補(bǔ)充
這篇綜述內(nèi)容還是很多的，也學(xué)到了許多關(guān)于ATAC-seq的新知識。
另外也找到一個生信分析的系列教程：
http:///new/book/chapter-05/#第四章-chip-seq數(shù)據(jù)分析chapter-4-chip-seq-data-analysis
有需求的同學(xué)可以自行學(xué)習(xí)~
另外放上我當(dāng)初學(xué)習(xí)ChIP-seq的代碼教程吧，因為當(dāng)初是第一次學(xué)習(xí)，所以很多就會相對比較細(xì)致了，但是也可能會存在一些問題，大家自行判斷學(xué)習(xí)：
九月學(xué)徒ChIP-seq學(xué)習(xí)成果展（6萬字總結(jié)）（上篇）
九月學(xué)徒ChIP-seq學(xué)習(xí)成果展（6萬字總結(jié)）（下篇）
后記
近來開學(xué)在即，本著不信謠不傳謠的黨中央精神，我在家默默看完了這篇文獻(xiàn)。希望大家也要在家堅持：不信謠不傳謠~
