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來源：生物世界 2022-06-01 11:56
可愛龍實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步在不影響 IscB 活性的情況下去除了 55 個(gè)氨基酸，使得最后的蛋白尺寸僅僅450個(gè)氨基酸，這是目前所知的最小 Cas9 同源體
CRISPR 基因編輯技術(shù)開創(chuàng)了遺傳疾病治療的新時(shí)代。諸如流行的 CRISPR-Cas9 之類的工具已在實(shí)驗(yàn)室中被設(shè)計(jì)用于治愈許多遺傳疾病，但是這些工具太大而無法有效地遞送給患者。
科學(xué)界的一項(xiàng)重大工作集中在嘗試使 CRISPR 工具小型化，使其足夠小以適應(yīng)當(dāng)前的遞送方法，例如腺病毒相關(guān)病毒（AAV）載體。在小型化 Cas9 工具方面，目前還沒有一種人工引導(dǎo)方法非常成功。
美國康奈爾大學(xué)可愛龍實(shí)驗(yàn)室解決了這個(gè)大小問題，成功解析“史上最小Cas9”的分子結(jié)構(gòu)——一種基于最近在轉(zhuǎn)座子中發(fā)現(xiàn)的，Cas9 遠(yuǎn)古親屬成員 IscB，該成員大小僅 Cas9 的三分之一左右。
該研究以：Structural basis for RNA-guided DNA cleavage by IscB-ωRNA and mechanistic comparison with Cas9 為題，發(fā)表于最新一期的 Science 期刊。
CRISPR-Cas9 系統(tǒng)使用RNA（gRNA）作為指導(dǎo)來識(shí)別目標(biāo) DNA 序列。當(dāng)找到匹配項(xiàng)時(shí)，Cas9 蛋白會(huì)在正確的位置剪斷目標(biāo) DNA，產(chǎn)生 DNA 雙鏈斷裂。Cas9 帶來了哪些治療可能性？為什么越小越好？
劉如謙（David Liu）曾表示，人們對 Cas9 小型化以擴(kuò)大使用范圍產(chǎn)生了濃厚的興趣。例如，需要將基于 Cas9 的基因組編輯器包裝到成熟的遞送工具中，例如腺相關(guān)病毒（AAV）載體。但在小型化 RNA 引導(dǎo)的核酸酶方面，無論是結(jié)構(gòu)引導(dǎo)方法還是定向進(jìn)化都不是特別成功。
基因編輯器需要很小，以便將它們裝入病毒載體中再進(jìn)一步遞送進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。可愛龍教授表示，有很多超級(jí)亮眼的應(yīng)用進(jìn)一步需要編輯器與其他酶和功能融合，但它們的尺寸更大。如果我們可以將它們裝入病毒載體中，就能更好的將它們遞送給患者。
近年，有研究表明 Cas9 廣泛存在著同源的 Isc 家族，此前，張鋒實(shí)驗(yàn)室在 Science 發(fā)表論文【2】，證明這些 Isc 家族是 Cas9 蛋白的遠(yuǎn)古祖先，擁有更小的尺寸以及更廣泛的生物界分布，并且已經(jīng)在哺乳細(xì)胞證明該家族蛋白有Cas9類似的基因編輯功能。
然而其究竟是以何種機(jī)制去執(zhí)行類似 Cas9 功能的依舊不清楚，以及當(dāng)前其編輯效率低下的問題也需要進(jìn)一步解決?！昂喍灾?，就是需要給大家展現(xiàn)出來，這個(gè) Cas9 的遠(yuǎn)古祖先到底以何種方式進(jìn)行自我組裝，執(zhí)行功能，如何避免脫靶，以及如何優(yōu)化提升效率，這些問題都需要依賴結(jié)構(gòu)生物學(xué)來全面解析。”可愛龍教授說道。
可愛龍實(shí)驗(yàn)室通過高分辨率結(jié)構(gòu)解析，發(fā)現(xiàn) IscB 雖然蛋白尺寸很小，但是通過 ωRNA 系統(tǒng)融合到引導(dǎo) RNA，再將剩余的 ωRNA 替換部分 Cas9 蛋白來實(shí)現(xiàn)更小的尺寸。通過用 ωRNA 替換較大 Cas9 中的蛋白質(zhì)成分，IscB 蛋白依舊保持核心化學(xué)（DNA切割）反應(yīng)中心。
Δ Movie: Cas9和IscB的比較。IscB尺寸不及Cas9一半，并且通過ωRNA的結(jié)構(gòu)化來替換Cas9大部分蛋白區(qū)域，從而實(shí)現(xiàn)蛋白尺寸的簡化。橘黃色:guide RNA序列;淡黃色:RNA骨架;紅色：non-target strand;藍(lán)色：Target strand;灰色為蛋白骨架，藍(lán)色:HNH核酸酶，紫色:RuvC核酸酶。
“這是關(guān)于了解分子的結(jié)構(gòu)以及它們?nèi)绾芜M(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，”共同第一作者、微生物學(xué)領(lǐng)域的博士生 Gabriel Schuler 說， “研究這些 Cas9 遠(yuǎn)古結(jié)構(gòu)為我們提供了一個(gè)新的起點(diǎn)，可以生成更強(qiáng)大、更易于使用的基因編輯工具?！?/section>
人們認(rèn)為轉(zhuǎn)座子是 CRISPR 系統(tǒng)的進(jìn)化前體。“細(xì)菌內(nèi)部的這些系統(tǒng)每分鐘都在不斷地被選擇——大自然基本上已經(jīng)擲骰子數(shù)十億次，并想出了這些非常強(qiáng)大的工具?，F(xiàn)在，通過以高分辨率定義它們，我們可以利用它們的力量，”可愛龍教授表示。
一個(gè)更大的疑問是，這么小巧的Cas9同源物，以何種方式去避免脫靶，防止自我損傷？研究團(tuán)隊(duì)通過多種狀態(tài)的比較，發(fā)現(xiàn) IscB 在16個(gè)堿基的 guide 序列和 target DNA 沒有完全互補(bǔ)配對時(shí)，其 Non-target strand 會(huì)以空間位阻的形式阻礙HNH核酸酶去結(jié)合 Target strand，這種結(jié)局就是兩條鏈都不會(huì)被切割，從而保證了安全性。而 guide 序列和 target DNA 完全互補(bǔ)配對了，確定是“正確的人”之后，該狀態(tài)其更大的 R-loop 空間會(huì)允許 HNH 結(jié)構(gòu)域結(jié)合 target strand，從而引發(fā)切割，HNH 的運(yùn)動(dòng)又將 Non-target strand 推給 RuvC 核酸酶，引發(fā)第二步切割。
IscB功能機(jī)制圖：在沒有確定是對的目標(biāo)DNA底物的情況下（左），non-target strand DNA(NTS)通過空間位阻阻礙HNH核酸酶接近target strand （TS）,從而防止脫靶錯(cuò)切；當(dāng)確定了正確的底物之后（中），更大的R-loop允許了HNH核酸酶結(jié)合TS，進(jìn)行切割；HNH會(huì)進(jìn)一步將NTS推給RuvC核酸酶，進(jìn)行第二步切割，最終產(chǎn)生雙鏈斷裂。
Δ Movie: IscB激活機(jī)制。通過non-target strand的空間走向來決定核酸酶切割行為。當(dāng)是錯(cuò)誤底物時(shí)，無法打開full R-loop, 因此阻礙進(jìn)一步的切割，而正確的底物會(huì)打開full R-loop,最后激活雙酶切割，實(shí)現(xiàn)雙鏈斷裂。
IscB 依舊足夠小巧，然后可愛龍實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步在不影響 IscB 活性的情況下去除了 55 個(gè)氨基酸，使得最后的蛋白尺寸僅僅450個(gè)氨基酸，這是目前所知的最小 Cas9 同源體，他們希望使這種基因組編輯器的未來版本更小，因此更有用。
共同第一作者、康奈爾大學(xué)分子生物學(xué)和遺傳學(xué)系博士后胡純一表示，更好地了解 RNA 的功能是該研究背后的一個(gè)動(dòng)機(jī)。還有很多謎團(tuán)——比如為什么轉(zhuǎn)座子使用 RNA 引導(dǎo)系統(tǒng)？RNA起什么作用？RNA自身能否進(jìn)一步進(jìn)化為更小尺寸？這些在今后還有很多工作可以做…
研究團(tuán)隊(duì)仍然面臨的一個(gè)挑戰(zhàn)是，雖然 IscB-ωRNA 在試管中非?；钴S，幾分鐘就能完成切割雙鏈DNA，但它在改變?nèi)祟惣?xì)胞中的染色體 DNA 方面并不那么有效。他們研究的下一步將是利用分子結(jié)構(gòu)來探索他們已經(jīng)確定的導(dǎo)致人體細(xì)胞活性低的原因并實(shí)現(xiàn)優(yōu)化。
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