本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及大麗輪枝菌的致病基因、蛋白及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

由土壤絲狀真菌大麗輪枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)所引起的棉花黃萎病是一種土壤傳播的維管束病害,病原菌變異較快，具有分布廣、危害重、存活時間長、化學農(nóng)藥難于防治等特點，是棉花生長過程中最具毀滅性的病害之一，嚴重威脅著棉花的生產(chǎn)和發(fā)展。棉花黃萎病1914年始見于美國的費吉尼亞州，隨后在其它州和世界各植棉國先后發(fā)現(xiàn)(沈其益，1992),1935年隨引進美棉品種傳入中國，但危害不重。到二十世紀50年代以后，黃萎病在我國南北局部棉區(qū)陸續(xù)發(fā)生，擴散蔓延速度加快。80年代末，黃萎病已遍及全國478個植棉縣(市)。進入90年代以來，中國棉花黃萎病擴展蔓延迅猛，尤其是1993,1995,1996,2002年在全國范圍內(nèi)連續(xù)大發(fā)生，損失嚴重。據(jù)2012年第11屆國際輪枝菌大會的報導(dǎo)，棉花2005-2010年世界平均年產(chǎn)量2352萬噸，因輪枝菌病害造成的損失高達年產(chǎn)的30％，每1％產(chǎn)量的損失相當于損失3.54億美元。中國是棉花生產(chǎn)大國，全國棉花種植面積近億畝，棉產(chǎn)量占全球棉花總產(chǎn)量的四分之一。棉花生產(chǎn)的好壞不但直接影響著棉農(nóng)的收入和生活，對輕紡、外貿(mào)及國防建設(shè)也有重大的影響。然而棉花黃萎病在世界范圍內(nèi)的盛行，嚴重威脅著棉花的生產(chǎn)和發(fā)展。在中國的棉花主要生產(chǎn)區(qū)新疆，每年因為黃萎病引起的棉花減產(chǎn)問題非常嚴重，給棉農(nóng)及國家造成了很大的經(jīng)濟損失。棉花黃萎病已成為棉花生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的主要障礙之一，被稱為“棉花的癌癥”(簡桂良等.2003),并已成為當前制約我國棉花生產(chǎn)的突出問題。

大麗輪枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)屬半知菌亞門，叢梗抱目，淡色孢科，輪枝菌屬。大麗輪枝菌的寄主范圍很廣，涉及十字花科、薔薇科、 豆科、茄科、唇形花科、菊科等，目前已達660多種植物，并且還在逐年擴大。關(guān)于棉花黃萎病的致病機制有多種解釋，其中以導(dǎo)管堵塞和中毒兩種觀點為主。60年代人們對該病菌致病機制的認識是由于菌體在導(dǎo)管內(nèi)定殖，并大量繁殖，同時刺激鄰近的薄壁細胞產(chǎn)生膠狀物質(zhì)及侵填體而堵塞導(dǎo)管，阻礙水分的運轉(zhuǎn)，從而導(dǎo)致棉株萎焉(Garber,1966)。馬遠莉等(1990)對棉花各部位黃萎病菌在導(dǎo)管中的分布情況研究后認為，正常的次生木質(zhì)部導(dǎo)管的潛在輸水能力遠遠超過植物的總需水量，而且被堵塞的導(dǎo)管數(shù)占整個維管束的比例不大(最大的有17.7％)，因此導(dǎo)管堵塞不是導(dǎo)致棉花萎焉的主要原因。Keen等(1972)認為，黃萎病菌在代謝過程中產(chǎn)生的毒素為有毒的蛋白質(zhì)，是一種酸性蛋白質(zhì)一脂多糖的復(fù)合體。該復(fù)合物對感病棉花品種的葉片與根組織的細胞膜具有破壞作用，使細胞內(nèi)K⁺和Na⁺大量滲漏。而抗病品種的細胞膜不具備毒素作用的受體位點而不受毒素破壞。Wang等(2004)從黃萎病原菌的菌絲中分離到一個新的具有對棉花葉片有致萎作用的蛋白VdNEP。該蛋白可以誘導(dǎo)煙草葉片形成壞死斑，也可以使擬南芥產(chǎn)生抗病反應(yīng)，因此該蛋白可能參與了黃萎病菌對棉花侵染時的互作反應(yīng)。但目前尚不清楚該蛋白是否與以前己分離的毒素蛋白是同一物質(zhì)?，F(xiàn)在越來越多的研究表明，黃萎病菌分泌的毒素是導(dǎo)致黃萎病的關(guān)鍵生化因子，同時組織導(dǎo)管的阻塞影響水分運輸可能加劇了病癥的產(chǎn)生。

大麗輪枝菌是一種土傳真菌，在干燥惡劣的環(huán)境下能夠產(chǎn)生其休眠結(jié)構(gòu)微菌核，從而在土壤中存活多年。所以微菌核的形成與其致病性息息相關(guān)。2004年，Dobinson KF等(Dobinson,K.F.,et al.,2004)利用改造了的EZ::TN轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，對來源于番茄的大麗輪枝菌的胰蛋白酶VTP1成功的進行了定向敲除。該基因能夠促進微菌核的形成，但是敲除以后沒有影響其致病性及生長特性。2005年，Dobinson KF等對來源于萵苣和番茄的大麗輪枝菌的細胞分裂素活化蛋白激酶基因VMK1進行了敲除。敲除VMK1后菌株對各種宿主的致病性嚴重衰退，說明MAP激酶介導(dǎo)的信號通路在真菌致病性上起著重要作用。并且基因的敲除減少了孢子的產(chǎn)生和微菌核的形成，說明該基因可能參與多個細胞進程。

由于棉花黃萎病危害的嚴重性和寄主的廣泛性，世界上不少國家的科技工作者對其進行了深入研究。植物在與病原物的長期協(xié)同進化過程中獲 得了一系列復(fù)雜的防御機制保護自己，抗性表現(xiàn)為組成型抗性和誘導(dǎo)型抗性，誘導(dǎo)型抗性又包括組織結(jié)構(gòu)抗性和生理生化抗性。對黃萎病抗性不同的棉花品種在組織結(jié)構(gòu)方面存在一定差異，己被國內(nèi)外不少研究證實?？共∑贩N木質(zhì)部的細胞間隙較小，細胞壁較厚，且木質(zhì)部中含有較多的髓射線。另外，抗病品種的導(dǎo)管腔和木質(zhì)部的纖維腔直徑小于感病品種，說明棉花品種對黃萎病的抗性與其具有堅實的木質(zhì)部有關(guān)。棉花的生理生化抗病性方面己有過較多的研究，研究較多的抗病相關(guān)因子包括:植保素、單寧、可溶性糖、氨基酸及多種酶類。棉株在遭受病菌侵襲后，內(nèi)部產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，主要包括棉酚、植保素、單寧等，另外還與一些酶類、蛋白以及小分子物質(zhì)如H202。它們的作用是非專化性，與植物的基礎(chǔ)抗性相關(guān)。棉花抗黃萎病的機制是一個非常復(fù)雜的問題，涉及的因素眾多，因此不斷深入研究這些抗病反應(yīng)產(chǎn)物在基因表達水平上的規(guī)律，對于進一步深入了解抗病機制和利用基因工程手段改造棉花品種抗性具有重要意義。

抗病基因的獲得是選育抗病品種的重要基礎(chǔ)，目前通過分子生物學手段己經(jīng)克隆的植物抗病基因有39個以上，其中抗病原真菌的大概有20多個，如擬南芥抗白粉病基因RPW8，番茄抗枯萎病基因泌Ve，高梁抗普通銹病(Puccinia Sorghi)基因Rpl-D，且在海島棉上已經(jīng)克隆了NBS-LRR類抗病基因。在常規(guī)育種上，國內(nèi)外棉花育種者一直重視抗源的篩選和創(chuàng)造。1983-1986年李成葆等161對911份陸地棉資源進行了抗黃萎病鑒定，篩選了抗性較好的一批抗(耐)病品種。K.V.Srinvasin鑒定了126個海島棉品種的抗性，結(jié)果顯示表現(xiàn)耐病和抗病的占85％。無論是通過常規(guī)方法尋找抗源，還是通過分子生物學手段克隆抗病基因都已經(jīng)取得了一定的進展，但還沒有找到真正防治棉花黃萎病的有效辦法。根本原因在于棉花等作物遺傳背景復(fù)雜，很難在分子水平進行更深入的研究，另外大麗輪枝菌小種分化變異性強等原因也為抗病遺傳育種帶來重重困難。因此，研究棉花黃萎病病原大麗輪枝菌與寄主植物互作的分子機理至關(guān)重要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種大麗輪枝菌的致病基因、蛋白及其應(yīng)用，該致病基因、蛋白與大麗輪枝菌導(dǎo)致棉花黃萎病的機理具有緊密聯(lián)系，通過敲除該 致病基因可以降低大麗輪枝菌的致病性。

本發(fā)明的一個方面，提供一種大麗輪枝菌的致病蛋白，命名為HiC-15(isotrichodermin C-15hydroxylase)，來自大麗輪枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)，所述蛋白具有導(dǎo)致棉花黃萎病的作用，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)：

1)氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白質(zhì)；

2)將SEQ ID NO：2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與大麗輪枝菌致病相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明的另一方面，提供一種大麗輪枝菌的致病基因(命名為HiC-15)，該基因編碼的蛋白具有導(dǎo)致棉花黃萎病的作用，是如下1)至4)中任一所述的基因：

1)核苷酸序列如SEQ ID NO：1中自5′末端第1-62位、第120-722位、第780-1012位和第1063-1741位所示的基因；

2)核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的基因；

3)在嚴格條件下與1)或2)限定的基因雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因；

4)與1)或2)限定的基因具有90％以上的同源性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。

SEQ ID NO：1由1742個脫氧核苷酸組成，序列表中SEQ ID NO：1的自5’端第1-62位；第120-722位；第780-1012位；第1063-1741位為ORF區(qū)，編碼SEQ ID NO：2中所述氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，將SEQ ID NO：2所示的蛋白命名為HiC-15，將HiC-15蛋白的編碼基因命名為HiC-15。

所述“嚴格條件”為足以使核苷酸序列與SEQ ID NO：1所示的基因序列雜交的條件，這些條件對本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的，例如：在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下雜交，并用該溶液洗膜。

本發(fā)明還提供了以上所述基因的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。

“表達盒”意指能指導(dǎo)適合宿主細胞中特定核苷酸序列表達的核酸序列，包含與目的核苷酸序列可操作地連接的調(diào)控元件。所述調(diào)控元件可以是啟動子、增強子、靜默子、終止子和/或其它控制所述核苷酸序列表達的元件， 如聚腺苷酸化序列等。

本發(fā)明的再一個方面，提供以上所述基因的用途，在大麗輪枝菌中敲除以上所述的基因使大麗輪枝菌的致病性降低。

本發(fā)明的又一個方面，提供一種降低大麗輪枝菌致病性的方法，敲除以上所述的基因，具體包括如下步驟：

(1)使用兩對引物分別擴增SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示序列，將擴增后獲得的片段導(dǎo)入表達載體；

(2)通過步驟(1)中獲得的含有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示序列的片段的表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌；

(3)選取轉(zhuǎn)化成功的農(nóng)桿菌；

(4)通過步驟(3)中所述的轉(zhuǎn)化成功的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染大麗輪枝菌，選取具有抗性的菌株，即為致病性降低的菌株。

以上所述的方法，其中，步驟(1)中所述兩對引物序列如下：

上游引物1：5’→3’方向：GGGTTTAAUGCACCATTACGGATACAGAG(SEQ ID NO:5)；

上游引物2：5’→3’方向：GGACTTAAUGAGAGAAGCAACAAGGGAGA(SEQ ID NO:6)；

下游引物1：5’→3’方向：GGCATTAAUTACCTATTGACCTCCATCGC(SEQ ID NO:7)；

下游引物2：5’→3’方向：GGTCTTAAUAAGATTGAGCCCTATTTCCC(SEQ ID NO:8)。

以上所述的方法，其中，步驟(1)中還具體包括如下步驟：

通過所述上游引物1及所述上游引物2以大麗輪枝菌基因組DNA為模板PCR擴增SEQ ID NO：3所示序列的基因，所述下游引物1及所述下游引物2以大麗輪枝菌基因組DNA為模板PCR擴增SEQ ID NO：4所示序列的基因，將擴增后的兩種PCR產(chǎn)物都連接到表達載體。

以上所述的方法，其中，步驟(2)中通過電擊轉(zhuǎn)化的方法將所述含有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示序列的片段的表達載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞。

以上所述的方法，其中，步驟(3)中通過將所述農(nóng)桿菌涂布于含有抗 生素的平板上培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)化成功的菌株。

以上所述的方法，其中，步驟(4)中通過將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后的真菌菌株涂布于含有抗生素的平板上培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)化成功的菌株。

本發(fā)明提供的致病基因、蛋白經(jīng)實驗證明與大麗輪枝菌導(dǎo)致棉花黃萎病的機理具有緊密聯(lián)系，通過在大麗輪枝菌中敲除本發(fā)明的致病基因可以使大麗輪枝菌的致病性降低，將敲除了本發(fā)明致病基因的大麗輪枝菌突變體與野生型大麗輪枝菌同時侵染植株，被大麗輪枝菌突變株侵染的棉花相比野生型大麗輪枝菌侵染的棉花黃萎病發(fā)病率降低了40％以上，病情指數(shù)和病級數(shù)也有較大降低。因此本發(fā)明為研究大麗輪枝菌致病機理提供了新的啟示，為治療和預(yù)防棉花黃萎病提供了新的途徑。

附圖說明

圖1是實施例2中通過PCR檢測DNA水平HiC-15敲除突變體的對比電泳圖；泳道1為marker，泳道2,3,4為野生型大麗輪枝菌V592；泳道5,6,7為HiC-15敲除突變體Vda^Δhic-15-1；泳道8,9,10為HiC-15敲除突變體Vda^Δhic-15-2。野生型大麗輪枝菌V592用F1-HptR及HptF-R1這兩對引物擴增不出條帶，而Fg-Rg是可以擴增出條帶；相反，HiC-15敲除突變體Vda^Δhic-15-1和Vda^Δhic-15-2用F1-HptR及HptF-R1這兩對引物能夠擴增出條帶，而Fg-Rg是不能擴增出條帶的，說明HiC-15被敲除掉了；

圖2是HiC-15敲除突變體通過qRT-PCR檢測RNA水平中HiC-15表達情況的柱狀圖；

圖3是實施例4中未被侵染的對照棉花植株；

圖4是實施例4中被大麗輪枝菌V592侵染后的棉花植株；

圖5是實施例4中被大麗輪枝菌V592的敲除突變體Vda^Δhic-15侵染后的棉花植株；

圖6是實施例4中棉花植株被野生型大麗輪枝菌V592和敲除突變體Vda^Δhic-15侵染20天后的發(fā)病率對比圖；

圖7是實施例4中棉花植株被野生型大麗輪枝菌V592和敲除突變體Vda^Δhic-15侵染20天后的病情指數(shù)對比圖；

圖8是實施例4中棉花植株被野生型大麗輪枝菌V592和敲除突變體 Vda^Δhic-15侵染20天后的病級數(shù)對比圖。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明的具體實施方式進行更加詳細的說明，以便能夠更好地理解本發(fā)明的方案以及其各個方面的優(yōu)點。然而，以下描述的具體實施方式和實施例僅是說明的目的，而不是對本發(fā)明的限制。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中的根癌農(nóng)桿菌EHA105(Elizabeth E.Hood.NewAgrobacteriumhelper plasmids for gene transfer to plants.Transgenic Research,July 1993,Volume 2,Issue 4,pp 208-218)自申請日起二十年公眾可從中國科學院微生物研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。

下述實施例中的大麗輪枝菌V592(Feng-Gao,Bang-JunZhou,A Glutamic Acid-Rich Protein Identified in Verticillium dahliae from an Insertional Mutagenesis Affects Microsclerotial Formation and Pathogenicity.PLoS ONE 5(12):e15319.)自申請日起二十年公眾可從中國科學院微生物研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。

下述實施例中“野生型”意指不含有異源核酸分子的生物體，為非轉(zhuǎn)化的或非轉(zhuǎn)基因的生物體。

實施例1、HiC-15敲除載體的構(gòu)建

利用CTAB法提取大麗輪枝菌V592基因組DNA,利用以下引物以該基因組DNA為模板，利用C_xHotstart DNA聚合酶(Agilent)進行PCR擴增：上游引物1：5’→3’方向：GGGTTTAAUGCACCATTACGGATACAGAG(SEQ ID NO:5)；上游引物2：5’→3’方向：GGACTTAAUGAGAGAAGCAACAAGGGAGA(SEQ ID NO:6)；下游引物1：5’→3’方向：GGCATTAAUTACCTATTGACCTCCATCGC(SEQ ID NO:7)；下游引物2：5’→3’方向：GGTCTTAAUAAGATTGAGCCCTATTTCCC(SEQ ID NO:8)。 用USER enzyme mix(New England Biolabs)將兩種PCR產(chǎn)物同時連接到pGKO-HPT載體(Tian,L.,Chen,J.,Wang,J.,Wang,J.,and Dai,X.2011，自申請日起二十年公眾可從中國科學院微生物研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用)上，測序結(jié)果表明含有SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的DNA分子的重組載體確定為最終敲除載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)進野生型大麗輪枝菌V592中得到HiC-15敲除突變體。

實施例2、HiC-15敲除突變體的獲得

1)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對真菌進行遺傳轉(zhuǎn)化

相關(guān)培養(yǎng)基：

(a)查式培養(yǎng)基(30g/L蔗糖,3g/L NaNO₃,0.5g/L MgSO₄-7H₂O,0.5g/L KCl,100mg/L FeSO₄-7H₂O,1g/L K₂HPO₄,pH 7.2)。LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10g，酵母浸膏5g，水1000ml，用NaOH調(diào)pH至7,121℃，高壓蒸汽滅菌20min。

(b)LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl₅g，加水至1L，121℃，蒸汽滅菌20min。固體培養(yǎng)基加1.5％瓊脂。

(c)MM基本培養(yǎng)基：10mL K-bufer(200g/L K₂HPO₄,145g/L KH₂PO₄，H₃PO₃調(diào)節(jié)pH至7.0)，20mL M-N buffer(30g/L MgSO₄·7H₂O,15g/L NaCl)，1mL 1％的CaCl₂·2H₂O(w/v)，10mL 20％的蔗糖(w/v)，1mL 0.1％的FeSO₄(w/v)，0.5g NH₄NO₃，加蒸餾水至1L。113℃，蒸汽滅菌20min。

(d)IM誘導(dǎo)培養(yǎng)基：10mL K-bufer(pH 7.0)，20mL M-N buffer，1mL 1％CaC1₂·2H₂O(w/v)，2.5mL 20％的NH₄NO₃(w/v)，1mL 0.1％的FeSO₄(w/v)，5mL甘油，5mL 2mol/L的蔗糖，2mL 100mmol/L乙酰丁香酮，40mL 1mol/L的MES(pH 5.3)，加蒸餾水至1L。113℃，蒸汽滅菌20min。

(e)CM共培養(yǎng)培養(yǎng)基：IM培養(yǎng)基中加入1.5％瓊脂粉，113℃，蒸汽滅菌20min。

具體操作步驟

(1)挑取農(nóng)桿菌單菌落放入到5ml含有抗生素(50ug/ml卡那霉素，50ug/ml利福平)的LB液體培養(yǎng)基，置于28℃搖床上，200rpm培養(yǎng)24小 時，與此同時用牙簽挑取3個PDA固體培養(yǎng)基上的V592菌餅放入含有80ml查式培養(yǎng)基的三角瓶中，置于26℃搖床上，200rpm培養(yǎng)。

(2)取1ml培養(yǎng)了24小時的農(nóng)桿菌菌液加入到20ml含有抗生素(50ug/ml卡那霉素，50ug/ml利福平)的MM液體培養(yǎng)基中，置于28℃搖床上，200rpm繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，離心機上4000rpm離心10min，收集菌體，菌體用IM培養(yǎng)基洗兩次，再用IM培養(yǎng)基重懸，調(diào)OD₆₀₀≈0.25，將培養(yǎng)了48小時之后的野生型大麗輪枝菌V592用四層滅過菌的紗布過濾，將過濾好的菌液置于離心機上4000rpm，離心10min，用IM+AS重懸孢子，血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)孢子濃度為1.0×10^6-7個孢子/ml。

(3)將農(nóng)桿菌菌液和真菌孢子懸浮液按1：1體積比例混勻(各取1ml)，按照每培養(yǎng)皿200μl涂布于CM培養(yǎng)基平板上的玻璃紙，26℃培養(yǎng)36個小時。

(4)用3ml無菌水對共培養(yǎng)物進行沖洗，按照500ul/板涂布于含有抗生素(潮霉素50ug/ml,羧芐青霉素200ug/ml,頭孢霉素200ug/ml，20ug/ml五氟尿嘧啶)的PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)5-7天。

2)PCR鑒定HiC-15敲除突變體(圖1)

A、CTAB法提取HiC-15敲除突變體基因組DNA。

B、利用三對引物進行PCR擴增。第一對：在目的基因HiC-15的上游片段SEQ ID NO.3的上游設(shè)計一個引物F1:5’-ACATCCTGTTCAAACGGCTC-3’(SEQ ID NO:9),HPT BOX上的一個引物HptR：5’-AAATTTTGTGCTCACCGCCTGGAC-3’(SEQ ID NO:10)進行上游片段PCR擴增。第二對：在目的基因下游片段SEQ ID NO.4的下游再設(shè)計的一個引物，命名為R1:5’-GGAGTGTTGCCACCGAATGC-3’(SEQ ID NO:11)，在HPT BOX上的另一個引物HptF:5’-TCTCCTTGCATGCACCATTCCTTG-3’(SEQ ID NO:12)進行下游片段的擴增。如果引物對1和引物對2都能夠擴增出與預(yù)期大小相等的片段，說明重組是發(fā)生在目的基因的位置。第三對引物：Fg：5’-CGAAATCGATGGATCCTGGCTAACATCAGCCATCTG-3’(SEQ ID NO:13)，Rg：5’-AGGCTACGTAGGATCCCGTCATCAAACCCCAACTCT-3’(SEQ ID NO:14)用來擴增敲除的目的基因，不能擴增出片段表面目的基因確 實被敲除成功。

實施例3

利用CTAB法提取大麗輪枝菌V592及Vda^Δhis-15基因組DNA,利用Sup erScript III reverse transcriptase(Promega Corporation)反轉(zhuǎn)錄試劑盒，得到V592及Vda^Δhis-15的cDNA，qRT-PCR分析使用的是One-Step RT-PCR kit試劑盒(ABM,Inc.)，儀器是1000series Thermal Cycling Platform(Bio-Rad Laboratories,Inc.)。實驗中需要用到兩對引物，一對是HiC-15-q-f:5’-GCAAGTTTGGTGATGTGGAGGAA-3’(SEQ ID NO:15),HiC-15-q-r：5’-GCACGGAGAATGGGCAGAA-3’(SEQ ID NO:16)；另一對為內(nèi)參引物：VdELF-F：5’-CCATTGATATCGCACTGTGG-3’(SEQ ID NO:17)，VdELF-R：5’-TGGAGATACCAGCCTCGAAC-3’(SEQ ID NO:18)。結(jié)果如圖2所示。

實施例4 敲除突變體的致病性檢測

通過菌株侵染水培棉花來鑒定其致病性。挑選飽滿的棉種用15％的次氯酸鈉浸泡30min后，無菌水沖洗2-3遍，再用無菌水浸泡催芽過夜后平鋪在培養(yǎng)盒中保濕，待芽長至3cm，種于發(fā)芽盒中。將長出子葉的苗轉(zhuǎn)移到盛滿清水的塑料盒(高8-10cm)中，于25℃，光照16h，黑暗8h培養(yǎng)。待真葉長出時將清水換成1/3的MS培養(yǎng)液，每周更換一次培養(yǎng)液，1片真葉展平時接種。將-80℃保存的大麗輪枝菌V592菌株和HiC-15敲除突變體Vda^Δhis-15經(jīng)PDA平板活化3-4d，從菌落邊緣挑取菌塊放入查氏培養(yǎng)液，25℃，220rpm搖培5d，過濾，濾液5000rpm離心5min，清水稀釋孢子，血球計數(shù)板計數(shù)，將濃度調(diào)至1×10⁷個孢子/ml。將調(diào)好濃度的孢子懸浮液加入空塑料盒中，棉苗浸根40min。之后用1/3的MS培養(yǎng)液25℃光照16h，黑暗下繼續(xù)培養(yǎng)棉苗8h。每盒中種12株苗，每個品種3個重復(fù),對照棉苗用清水浸泡40min。20后觀察發(fā)病情況(見圖3至圖5)。

通過上述方法，我們驗證了HiC-15敲除突變體對棉花的致病性明顯減弱

計算發(fā)病率和病情指數(shù)：

發(fā)病率＝發(fā)病數(shù)/調(diào)查總數(shù)×100％(見圖6)

病情指數(shù)＝∑[病級數(shù)×該級病葉(穗、株)數(shù)]/(調(diào)查總數(shù)×最高病級數(shù)) ×100(見圖7)

發(fā)病分級標準：

0級植物健康沒有癥狀；

1級0.1％-25％的葉片萎蔫；

2級25％-50％的葉片萎蔫；

3級50％-75％的葉片萎蔫；

4級75％-100％的葉片萎蔫或者死亡；

野生型大麗輪枝菌V592侵染的棉花與敲除突變體V592^ΔisotC-15HO侵染的棉花的發(fā)病分級標準統(tǒng)計圖(見圖8)。

通過上述方法的結(jié)果圖，我們可以看出敲除突變體V592^ΔisotC-15HO侵染棉花相比于野生型大麗輪枝菌V592侵染棉花發(fā)病率、病情指數(shù)及發(fā)病分級都明顯降低，說明HiC-15基因與大麗輪枝菌的致病性相關(guān)。

最后應(yīng)說明的是：顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引申出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之中。