Cell：?jiǎn)渭?xì)胞組學(xué)技術(shù)揭示人類原始生殖細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和DNA甲基化圖譜

人類原始生殖細(xì)胞產(chǎn)生于胚胎發(fā)育的早期，是發(fā)育為成熟的精子和卵細(xì)胞的前體細(xì)胞，精卵結(jié)合后會(huì)發(fā)育成新的個(gè)體、并將遺傳物質(zhì)傳遞給下一代以維持種族的延續(xù)。因此，對(duì)人類早期胚胎以及原始生殖細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程進(jìn)行深入的研究對(duì)于理解人類胚胎發(fā)育特征以及對(duì)于反復(fù)流產(chǎn)、胚胎停育、不孕不育等疾病發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)具有重要意義。今天，我們就一起來(lái)看一篇利用單細(xì)胞甲基化測(cè)序技術(shù)研究原始生殖細(xì)胞的Cell封面文章（The Transcriptome and DNA Methylome Landscapes of Human Primordial Germ Cells）。

介紹

本文使用了作者開(kāi)發(fā)的單細(xì)胞RNA測(cè)序(RNA-seq)方法分析了來(lái)自妊娠4至19周的15個(gè)胚胎的233個(gè)男性和女性原始生殖細(xì)胞(PGCs)以及其中13個(gè)胚胎的86個(gè)鄰近體細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本。此外，作者還利用全基因組測(cè)序技術(shù)(WGBS)分析了男性和女性性腺PGCs的DNA甲基組，以及其中11個(gè)胚胎在妊娠7-19周時(shí)的鄰近體細(xì)胞。

結(jié)果

人類PGC細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜

通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究了人類PGS細(xì)胞在7-19周的不同細(xì)胞不同發(fā)育階段的不同表達(dá)模式，首先，作者對(duì)單個(gè)生殖細(xì)胞及其鄰近的體細(xì)胞進(jìn)行了非監(jiān)督的層次聚類分析，對(duì)照組選擇了11個(gè)來(lái)自胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)的單個(gè)細(xì)胞。其中，作者對(duì)PGS細(xì)胞在有絲分裂及減數(shù)分裂階段的不同基因表達(dá)特點(diǎn)經(jīng)行了深入的分析，結(jié)果表明人類有絲分裂的PGCs清楚地表達(dá)多能性標(biāo)記基因，如Pou5f1(也被稱為OCT4)、NANOG、ZFP42(也被稱為REx1)、DPPA3(也被稱為Stella)、SALL4和Lin28a，但不像以前報(bào)道的那樣表達(dá)SOX2（圖1）。

人原始生殖細(xì)胞基因表達(dá)譜的動(dòng)態(tài)變化

接下來(lái)，作者分析了ICM、PGCs和周圍體細(xì)胞之間的主要差異。作者發(fā)現(xiàn)了988個(gè)有絲分裂PGC特異基因和1,325個(gè)性腺體細(xì)胞特異基因(圖2A)。通路分析表明，PGCs高度富含與堿基切除修復(fù)(BER)途徑有關(guān)的基因，與處于類似發(fā)育階段的小鼠PGCs相似。這一發(fā)現(xiàn)表明，性腺PGCs可能對(duì)BER相關(guān)機(jī)制有很強(qiáng)的需求，可能是由于整體DNA去甲基化和其他表觀遺傳的重編程過(guò)程。此外，在體細(xì)胞的不同階段的特征性基因及所涉及的通路中，作者發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)育的進(jìn)程一些細(xì)胞全能性相關(guān)的基因表達(dá)在下降，并且發(fā)現(xiàn)同女性相比，男性性腺的PGS細(xì)胞具有更多的特異性表達(dá)基因(圖2C)。

人女性生殖細(xì)胞X染色體的再激活

在小鼠雌性PGC發(fā)育過(guò)程中，失活的X染色體在E8.5至E12.5之間重新激活。作者通過(guò)分析X染色體上基因的表達(dá)來(lái)分析人類PGCs的這種行為。4~11周雄性PGCs X染色體上基因的總表達(dá)水平是雌性的1.6倍（圖3）。這表明失活的X染色體在4周后已經(jīng)在雌性生殖細(xì)胞中重新激活。此外，作者還分析了X染色體上基因的等位基因特異性表達(dá)。在4周胚胎中，雌性生殖細(xì)胞顯示HDHD1基因的雙等位基因表達(dá)，而同一胚胎中的性腺體細(xì)胞顯示單等位基因表達(dá)。這表明，在妊娠4周后，原核細(xì)胞中失活的X染色體已經(jīng)重新激活，并表現(xiàn)出雙等位基因的表達(dá)。

人PGCs的動(dòng)態(tài)甲基組分析揭示了DNA低甲基化模式

為了了解DNA甲基化對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，作者還對(duì)人PGCs進(jìn)行了WGBS分析。分析表明，13周和19周胚胎的雄性PGCs中的甲基化水平保持在較低水平，這意味著19周后雄性PGCs應(yīng)該會(huì)發(fā)生整體重新甲基化。在PGCs的整體去甲基化過(guò)程中，性腺體細(xì)胞如預(yù)期的那樣保持了高水平的DNA甲基化。同時(shí)，作者還分析了女性生殖細(xì)胞的DNA甲基組情況。在10周胚胎中，雌性生殖細(xì)胞的DNA甲基化水平最低，這表明10周女性胚胎中的PGC以及11周男性胚胎中的PGC具有非常低甲基化的基因組(圖4A)。這表明，女性生殖細(xì)胞的再甲基化始于妊娠11周，這比男性生殖細(xì)胞的甲基化要早得多。且基因區(qū)的去甲基化與基因間區(qū)的高度甲基化同時(shí)存在，而5hmC的狀態(tài)與甲基化的模式相反(圖4G)。

人生殖細(xì)胞功能基因組元件的甲基化動(dòng)力學(xué)研究

總體而言，不同功能基因組元件上的DNA去甲基化反映了整體模式，但程度不同。一些轉(zhuǎn)座子原件的活化與一些甲基化的殘基具有相關(guān)性。分析表明，在懷孕5周的時(shí)候PGS中90%以上的轉(zhuǎn)座子原件處于甲基化狀態(tài)，而到了10周或11周的時(shí)候這一數(shù)字降到了8%，一些進(jìn)化上更年輕的轉(zhuǎn)座子原件，在整個(gè)基因組表現(xiàn)出低甲基化狀態(tài)時(shí)仍表現(xiàn)出更高的甲基化及基因表達(dá)狀態(tài)，說(shuō)明了一些表觀遺傳性狀的可遺傳特征。

DNA甲基化與基因表達(dá)的關(guān)系

基因啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化通常代表相應(yīng)基因的表達(dá)。作者分析了相應(yīng)基因啟動(dòng)子區(qū)域的RNA表達(dá)與DNA甲基化的關(guān)系。作者發(fā)現(xiàn)，即使在整體去甲基化后，這些區(qū)域之間的負(fù)相關(guān)性仍然存在于PGCs中，就像在體細(xì)胞中一樣。但是，與鄰近性腺體細(xì)胞的負(fù)相關(guān)程度，尤其是10周胚胎的雌性原生殖細(xì)胞，在原生殖細(xì)胞中較弱。這表明，盡管啟動(dòng)子DNA甲基化仍然抑制基因在PGCs中的表達(dá)，但其調(diào)節(jié)程度明顯低于體細(xì)胞。然而，已有研究表明，基因體中的DNA甲基化通常與基因表達(dá)呈正相關(guān)。作者分析了這種差異，發(fā)現(xiàn)未表達(dá)的基因在基因體中的DNA甲基化水平仍然低于表達(dá)的基因，這表明基因體中的DNA甲基化仍然潛在地促進(jìn)了PGC中的基因表達(dá)，盡管程度要小得多。

結(jié)論

人類遷移期到性腺時(shí)期PGCs的轉(zhuǎn)錄組和DNA甲基化組總體上與小鼠PGCs在可比階段的相似。同時(shí)，人PGCs也表現(xiàn)出不同于小鼠PGCs的獨(dú)特特性，具有獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄模式，能同時(shí)表達(dá)多能性基因與生殖系特異的基因，此外，人類原始生殖細(xì)胞存在全基因組范圍的去甲基化。作者的工作為闡明人類PGCs整體表觀遺傳重編程過(guò)程中DNA甲基化和基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜關(guān)系鋪平了道路。

重點(diǎn)來(lái)了！

關(guān)于單細(xì)胞及微量樣本DNA甲基化測(cè)序(Micro DNA-BS)

單細(xì)胞及微量樣本的DNA甲基化組學(xué)研究很大程度上受制于建庫(kù)技術(shù)。傳統(tǒng)的文庫(kù)構(gòu)建方法或類似于基因組DNA的單細(xì)胞擴(kuò)增技術(shù)很難應(yīng)用到甲基化實(shí)驗(yàn)過(guò)程中。易基因建立了一系列微量及單細(xì)胞甲基化檢測(cè)方法，可對(duì)于不同項(xiàng)目需求，個(gè)性化提供檢測(cè)方案，在全基因組、簡(jiǎn)化基因組、靶基因等范圍開(kāi)展甲基化檢測(cè)。

易基因建立的單細(xì)胞及微量樣本DNA甲基化測(cè)序技術(shù)包括：

應(yīng)用方向：

單細(xì)胞及微量珍稀樣本的甲基化研究主要應(yīng)用于腫瘤發(fā)生機(jī)制，癌癥研究，胚胎植入前診斷，胚胎早期發(fā)育，生殖細(xì)胞重組，干細(xì)胞及細(xì)胞異質(zhì)性等研究領(lǐng)域。應(yīng)用的樣本包括單細(xì)胞、微量細(xì)胞、微量DNA等。特別適用于難以取得的珍稀樣本和細(xì)胞異質(zhì)性較大的組織樣本。

技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

1）微量細(xì)胞或單細(xì)胞全基因組甲基化測(cè)序（Micro DNA-WGBS）DNA起始量：

單細(xì)胞/100-1000個(gè)細(xì)胞

1ng基因組DNA

90%以上基因組CG覆蓋

2）微量細(xì)胞或DNA簡(jiǎn)化基因組甲基化測(cè)序（Micro DNA-XRBS）DNA起始量：

1ng基因組DNA；

10-20M有效CG位點(diǎn)覆蓋；

20G測(cè)序數(shù)據(jù)量。

有DNA甲基化測(cè)序或組學(xué)研究的老師，可咨詢了解。

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