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導(dǎo) 語(yǔ)：今天的問(wèn)診案例，涉及到兩個(gè)常見(jiàn)詞匯：S/P值和Ct值。你可能常聽(tīng)到S/P值越高，抗體濃度越高。Ct值越低，感染某某豬病的可能性越高。但你是否懂其中的原理？先解決概念問(wèn)題。 什么是Ct值？ 想要知道Ct值，先要了解PCR。PCR，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，DNA聚合酶介導(dǎo)的合成DNA鏈的反應(yīng)。是對(duì)目標(biāo)DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增（大量的翻倍復(fù)制）的方法。 為什么對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增？因?yàn)橥ǔＧ闆r下病毒DNA的含量太低了，即使是經(jīng)過(guò)了提純，仍然沒(méi)辦法直接測(cè)量有無(wú)和多少，所以需要通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增。以目標(biāo)DNA為模板，對(duì)這段DNA進(jìn)行復(fù)制粘貼，使這段DNA能夠檢測(cè)到的量，甚至達(dá)到可以用肉眼看的到的量。 擴(kuò)增一次需要一個(gè)特定流程，即通過(guò)高溫使一個(gè)雙鏈DNA拆成兩個(gè)單鏈，然后降溫到聚合酶的活性溫度，聚合酶以兩個(gè)單鏈DNA作為模板，生成兩個(gè)新的雙鏈DNA，即實(shí)現(xiàn)了對(duì)原來(lái)DNA片段的“克隆”。所以PCR儀本質(zhì)是一個(gè)溫控設(shè)備，而其中用到的聚合酶當(dāng)然也必須是可以耐高溫的聚合酶。 如何確定要復(fù)制哪一段DNA，這時(shí)候就需要使用引物（與目標(biāo)DNA序列互補(bǔ)的一個(gè)短片段）來(lái)開(kāi)個(gè)頭，引導(dǎo)后續(xù)的合成，這樣就確保只對(duì)目標(biāo)DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增。 通過(guò)一次這樣的程序，1個(gè)目標(biāo)DNA片段變成了2個(gè)。而之后的流程則是重復(fù)這個(gè)程序，所以一個(gè)這樣的程序稱為一個(gè)循環(huán)（Circle）。原理上，如果只有1個(gè)目標(biāo)DNA片段，經(jīng)過(guò)1次循環(huán)獲得2個(gè)同樣的DNA片段，如果經(jīng)過(guò)5次循環(huán)得到2^5個(gè)同樣的DNA片段即32個(gè)，如果40個(gè)循環(huán)得到2^40次方個(gè)這個(gè)DNA片段，即1,099,511,627,776個(gè)。當(dāng)然如果原始樣本里沒(méi)有目標(biāo)DNA，0^40次方仍然是0。 當(dāng)然，這里有個(gè)前提，就是必須有足夠量的合成原料，即引物和游離核苷酸。所以PCR反應(yīng)中產(chǎn)生的DNA片段與細(xì)菌增值曲線類(lèi)似，前期指數(shù)增長(zhǎng)，后期原料耗盡則曲線拉平。 Ct值 在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)之上，通過(guò)一定的技術(shù)設(shè)計(jì)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)合成的DNA的數(shù)量進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，也就是實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，qPCR。 而測(cè)量的方法則一般是通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度來(lái)實(shí)現(xiàn)，比如可以在反應(yīng)體系中加入熒光染料（方法之一），這種染料特異性的摻入DNA鏈之后就會(huì)發(fā)出熒光。制造出的目標(biāo)DNA片段數(shù)量越多，則發(fā)出的熒光越強(qiáng)。 當(dāng)原始樣本中目標(biāo)DNA的越多，達(dá)到這個(gè)臨界值所需要的循環(huán)次數(shù)越小，所以Ct值越小意味著，原始樣本中這種DNA的濃度就越高，對(duì)于非瘟檢測(cè)來(lái)說(shuō)，就是感染越嚴(yán)重。 通常實(shí)時(shí)定量PCR跑40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，如果Ct值小于29被認(rèn)為是強(qiáng)陽(yáng)性，如果Ct值在30-37之間認(rèn)為是陽(yáng)性，Ct值在38-40則可能是含有最小量的目標(biāo)DNA，也可能是環(huán)境污染。 什么是S/P值？ 簡(jiǎn)單的說(shuō)，S/P值是酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)（ELISA）的一種結(jié)果形式。酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）  先在反應(yīng)容器的表面（微孔板）附著上需要檢測(cè)的抗體的特異性抗原，用來(lái)捕獲受測(cè)樣本中的抗體。把受測(cè)樣本注入微孔后，樣本中的抗體就會(huì)被之前加入的抗原捕獲在容器表面。 沖洗掉其他東西，剩下的就是沒(méi)用完的抗原和捕獲了抗體的抗原。這個(gè)時(shí)候當(dāng)然不能直接去數(shù)有多少個(gè)抗體，因?yàn)榭贵w太小了，是一個(gè)很弱的檢測(cè)信號(hào)，需要把這個(gè)信號(hào)放大。而酶就是那個(gè)信號(hào)放大器。 把酶連接在所測(cè)抗體的抗體上（抗抗體）構(gòu)成酶標(biāo)抗體，把酶標(biāo)抗體加入剛才的反應(yīng)容器，同樣的原理，酶標(biāo)抗體會(huì)被抗體捕獲。沒(méi)被捕獲的酶標(biāo)抗體會(huì)被沖洗掉。這個(gè)時(shí)候再加入顯色液，顯色液在酶的作用下變色，被捕獲的酶標(biāo)抗體越多，顏色越深。通過(guò)這種方法間接的實(shí)現(xiàn)了對(duì)抗體的有無(wú)和多少進(jìn)行了顯示。 此時(shí)可以用肉眼直接觀察，但是如果要精確測(cè)量就需要用到一個(gè)比色計(jì)（酶標(biāo)儀）。比色計(jì)的原理是向樣品孔中照射特定波長(zhǎng)的光，測(cè)量有多少光被吸收，就能得到每個(gè)樣品孔的吸光度的值。 吸光度值與抗體濃度存在一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系，因此只需要找到這個(gè)關(guān)系就可以把吸光度值轉(zhuǎn)化成抗體的濃度值。 一種方法是，把陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品做梯度稀釋，然后把不同稀釋濃度的吸光度值做一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后拿樣品的吸光度值去曲線上比對(duì)，就能夠獲得樣品中抗體的濃度數(shù)值。 當(dāng)然還有更簡(jiǎn)便的方法，即不做梯度稀釋，直接用樣品的吸光度值跟特定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值進(jìn)行比對(duì)。這也就是S/P值方法。
S/P值是一個(gè)比值。即S——Sample樣本的吸光度值，比，P——Positive陽(yáng)性對(duì)照的吸光度值。完整公式是： S/P = (樣本值-陰性對(duì)照值)/（陽(yáng)性對(duì)照值-陰性對(duì)照值) 所以如果S/P≥1 時(shí)，當(dāng)然肯定是陽(yáng)性，說(shuō)明樣本中抗體的濃度等于或超過(guò)了陽(yáng)性對(duì)照的濃度。S/P的值越大，抗體濃度越高。 如果S/P<1，會(huì)稍微復(fù)雜一些，小于1說(shuō)明樣品中的抗體量小于陽(yáng)性對(duì)照的量，但是少多少才是陰性？所以這個(gè)時(shí)候就需要用一個(gè)分界值來(lái)判定。這個(gè)分界值，一般需要廠家測(cè)量之后根據(jù)敏感度和特異度進(jìn)行制定，比如有的廠家藍(lán)耳病抗體的臨界值設(shè)置為0.4，也就是當(dāng)S/P<0.4 則可以判定為陰性，如果S/P>0.4則判定為陽(yáng)性。 再回到我們今天的問(wèn)診案例。 問(wèn)診案例一：養(yǎng)豬人：藍(lán)耳滅活苗與藍(lán)耳活疫苗的免疫S/P值看法一樣嗎？藍(lán)耳檢測(cè)S/P值是否越大越好？假如免疫藍(lán)耳滅活苗，S/P的數(shù)值在多少范圍內(nèi)合理？曹海濤：你好，目前實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)絕大多數(shù)都是ELISA試劑盒，它目的蛋白是病毒蛋白的N蛋白，不是中和抗體，所以代表不了中和抗體水平，更不能完全表示中和病毒能力。 我們主要是看豬群的抗體趨勢(shì)，綜合陽(yáng)性率、離散度、整齊度，再結(jié)合臨床癥狀，生產(chǎn)成績(jī)，一起判斷疾病的感染規(guī)律。無(wú)論滅活苗和活苗，都能干擾抗體的變化，請(qǐng)結(jié)合上述情況，綜合判斷，才能更趨近于真實(shí)。 養(yǎng)豬人：那藍(lán)耳監(jiān)測(cè)S/P的數(shù)值代表什么？離散度高能說(shuō)明什么問(wèn)題？S/P值陰性代表什么？S/P陽(yáng)性代表什么？S/P在1以下，在1到2之間，在2以上，各能說(shuō)明什么問(wèn)題？ S/P值超過(guò)3能說(shuō)明什么問(wèn)題？豬群是不是就不好養(yǎng)了？ 曹海濤：S/P值是檢測(cè)的計(jì)算結(jié)果，一般需要陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，S/P值=（樣品值-陰性對(duì)照平均值）/（陽(yáng)性對(duì)照平均值-陰性對(duì)照平均值）。一般S/P值大于0.4為陽(yáng)性，表示曾經(jīng)感染過(guò)野毒或接種過(guò)疫苗有抗體；小于0.4為陰性，沒(méi)有抗體保護(hù)，陰性暴露，易感染。 這個(gè)抗體是用檢測(cè)N蛋白的數(shù)量而表示的，但不代表中和抗體水平。所以我們需要看整體樣本是什么豬，哪個(gè)階段的，再看S/P值的分布，再分析。一般我們經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為數(shù)值大于3.5以上，急性感染；2.5～3.5之間，說(shuō)明病毒血癥幾率高；1.0～2.0，穩(wěn)定群；0.7～1.8，理想群。所以，不能單獨(dú)看一個(gè)或一組數(shù)據(jù)分析，最好有采樣合理分布，和近期3月內(nèi)其他檢測(cè)數(shù)據(jù)，相互結(jié)合分析。其實(shí)數(shù)值大小，和實(shí)驗(yàn)室、試劑盒、豬群本身、疫苗、野毒等都有直接相關(guān)性。離散度=本組數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)差/本組平均值*100%，離散度高，說(shuō)明整齊度差，感染風(fēng)險(xiǎn)高。 我們采樣的置信度很關(guān)鍵，采樣分布直接決定結(jié)果是否能真實(shí)反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果。而且不能單獨(dú)看一個(gè)值或一組值，一定要看趨勢(shì)。比如母豬個(gè)別2.5，符合正態(tài)分布，也可能是穩(wěn)定群；再比如保育豬1.8，也可能病毒血癥，易繼發(fā)細(xì)菌感染。如果群體大于3，可能感染野毒，處在病毒血癥階段。 問(wèn)診案例二：養(yǎng)豬人：老師好，產(chǎn)房仔豬睪丸液監(jiān)測(cè)藍(lán)耳抗原陽(yáng)性，Ct值34。場(chǎng)內(nèi)豬群未有臨床癥狀母豬群也沒(méi)有病毒血癥，但最近一個(gè)月流產(chǎn)指標(biāo)上升百分之一。這種情況可以正常的進(jìn)行藍(lán)耳疫苗的普免嗎？苑麟勇：您好，產(chǎn)房仔豬睪丸組織液藍(lán)耳病抗原陽(yáng)性，說(shuō)明母豬在排毒或母豬群藍(lán)耳病野毒活躍，這時(shí)建議母豬加強(qiáng)一次藍(lán)耳病疫苗，普免前后加強(qiáng)保健！ 養(yǎng)豬人：我們正常是1月份進(jìn)行普免，一年4次。監(jiān)測(cè)到抗原，我是想問(wèn)一下是先保健一下再進(jìn)行免疫，還是免疫與保健同時(shí)進(jìn)行？ 苑麟勇：建議免疫前后、免疫時(shí)可以同時(shí)保健！ |
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