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1.
RT-PCR，qPCR，Real-time PCR，RT-qPCR區(qū)分 RT-PCR指的是逆轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse Transcription PCR），在RT-PCR中，RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板通過PCR進行DNA擴增；qPCR和Real-time
PCR均指實時熒光定量PCR（Quantitative
Real-Time PCR），相較于常規(guī)PCR，qPCR能夠在每個循環(huán)周期內(nèi)對擴增產(chǎn)物進行實時定量，從而對起始模板數(shù)量進行精確的分析，具有高敏感度和特異性；RT-qPCR指的是實時逆轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse Transcription- quantitative PCR），是qPCR RT-PCR的組合，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后再作為模板進行qPCR定量分析。2. SYBR
Green I染料法 SYBR Green I染料：一種可以在PCR循環(huán)過程中隨著PCR產(chǎn)物的累計而對其進行檢測的高度特異性雙鏈DNA結(jié)合染料；原理：通過SYBR Green I染料與PCR過程中產(chǎn)生的雙鏈DNA結(jié)合，而對PCR產(chǎn)物進行實時檢測；過程：（1）在PCR過程中，DNA聚合酶可對目標序列進行擴增，產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，即“擴增子”；（2）SYBR
Green I染料與每一個新產(chǎn)生的雙鏈DNA分子進行結(jié)合；（3）隨著PCR的進擴增，越來越多的擴增子生成，由于SYBR Green I染料可與所有的雙鏈DNA結(jié)合，因此熒光強度也會隨著PCR產(chǎn)物的增加而增加；（如下圖所示）優(yōu)點：對DNA模板沒有選擇性，可用于監(jiān)測任何雙鏈DNA序列的擴增，運行成本低；缺點：SYBR Green I染料可能與非特異性的雙鏈DNA序列發(fā)生結(jié)合，產(chǎn)生假陽性信號。除此之外，需要不斷的優(yōu)化反應(yīng)體系以降低非特異性擴增。
圖片源自：https://www./faq-real-time-pcr 3. Taqman探針法 原理：通過熒光探針在PCR循環(huán)過程中隨PCR產(chǎn)物的累積而對其進行檢測。 過程：（如上圖所示） (1) 構(gòu)建Oligo探針：5’端標記熒光染料報告基團（Reporter, R），3’端標記淬滅基團(Quencher, Q)。當(dāng)探針保持完整時，淬滅基團的靠近會通過空間上的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）而顯著降低報告基團發(fā)射的熒光； (2) 如果存在目標序列，探針便會在其中一個引物結(jié)合位點的下游發(fā)生退火，并隨著引物的延伸通過Taq DNA聚合酶的5’核酸酶活性，完成切除； (3) 探針的切除將報告染料基團和淬滅染料基團進行分離，增強了報告染料基團的信號。并且可以將探針從目的鏈上去除，使引物繼續(xù)沿模板鏈末端延伸； (4) 每經(jīng)過一個循環(huán)，就會有更多的報告基因染料分子從各自的探針上切斷，熒光強度會隨著合成的擴增片段數(shù)量的增加而增加； 優(yōu)點：（相較于SYBR Green I染料法） (1) 高特異性和靈敏性：熒光探針只與目的序列結(jié)合，不受非特異性產(chǎn)物的影響； (2) 兼容多重反應(yīng)：由于不同波長的熒光報告基團可以標記不同的探針，因此可以選擇不同的報告基因染料標記探針，在一個反應(yīng)管內(nèi)同時擴增并檢測不同的序列； (3) 節(jié)省時間和原料成本：無需PCR后處理，減少分析工作量并節(jié)省材料成本； 缺點：需要根據(jù)不同的序列，合成不同的探針。 4. 絕對定量（Absolute Quantification） 原理：根據(jù)標準曲線對未知樣品進行的定量。 舉例：可以通過qPCR計算出待測樣本的初始拷貝數(shù)，如1ml血液里有多少個HBV病毒?？筛鶕?jù)病毒的拷貝數(shù)，監(jiān)控疾病狀態(tài)。 5. 相對定量（Relative Quantification） 原理：用于分析特定樣品相對于參照樣品某個基因表達量的變化。 舉例：用于檢測藥物引起的基因表達改變，將經(jīng)藥物處理樣品的特定目標基因的表達水平相對未處理樣品的基因表達水平進行比較。 7. 擴增曲線（Amplification Plot）PCR過程中，以循環(huán)數(shù)為橫坐標，以反應(yīng)過程中實時熒光信號為縱坐標制作的曲線。（如下圖所示）擴增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期。PCR起始時，熒光信號還未發(fā)生變化的幾個循環(huán)。即樣本的熒光背景值，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋。一般將PCR反應(yīng)前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，可通過算法去除。熒光域值設(shè)定在PCR擴增的指數(shù)期，缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，通常儀器會自動設(shè)置。如果手動設(shè)置，原則要大于樣本的熒光背景值，同時要盡量選擇進入指數(shù)期的最初階段。11.循環(huán)閾值（Cycle
Threshold, Ct值）Ct值是指在熒光 PCR 擴增過程中，當(dāng)擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)。Ct值與模板的拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，經(jīng)過的循環(huán)數(shù)就越少，Ct 值也就越小。用作熒光信號標準化內(nèi)部參照，可以逐孔校正因移液不準確、孔位置及熒光波動造成的變動。通常，不同儀器有不同ROX需求，目前國產(chǎn)儀器基本無需ROX校準要求。熒光染料報告基團（Reporter, R）釋放的熒光強度除以惰性參比染料的熒光強度。在特定PCR條件設(shè)置下所產(chǎn)生的信號量級。ΔRn=(Rn )
– (Rn-)，Rn : 一次反應(yīng)的Rn值，Rn-：未反應(yīng)樣品的Rn值。
qPCR擴增完成后，對PCR產(chǎn)物加熱，隨溫度升高，DNA逐漸解鏈，導(dǎo)致熒光強度下降，當(dāng)?shù)竭_某一溫度時（Tm），會導(dǎo)致大量的產(chǎn)物解鏈，熒光急劇下降。熔解曲線分析可以用來確定不同的反應(yīng)產(chǎn)物，對PCR的特異性進行鑒定。（如下左圖所示）DNA雙鏈解鏈一半的溫度稱為熔解溫度（Tm），不同序列的DNA，Tm值不同。G-C含量越高，Tm值越高，成正比關(guān)系。17.對數(shù)曲線（logarithm
curve）對熔解曲線取對數(shù)，形成峰圖，更直觀的顯示PCR產(chǎn)物片段的情況。通常根據(jù)引物設(shè)計原則，擴增產(chǎn)物長度在80-300 bp范圍內(nèi)，熔解溫度在80℃-90℃之間。（如下右圖）用于構(gòu)建標準曲線的已知濃度樣品，為保證標準品的穩(wěn)定，通常將基因片段克隆到質(zhì)粒后，作為標準品。將已知濃度的標準品進行梯度稀釋（通常為5-6個稀釋梯度），將未知樣品和梯度稀釋的標準品在同一qPCR實驗中進行反應(yīng)。根據(jù)擴增曲線，以稀釋標準品的Ct值為橫坐標，起始拷貝數(shù)的log值為縱坐標構(gòu)建。（如下圖所示）理論上，稀釋樣品的擴增曲線之間有均勻的間距，如果產(chǎn)物在每一循環(huán)都加倍，熒光曲線之間的間距（兩個樣本Ct值差）符合等式“2n＝稀釋倍數(shù)”，如：10倍稀釋的樣本，2n＝10，n=3.32，即Ct值差為3.32。20.擴增效率（Amplification
efficiency）擴增效率與標準曲線的斜率相關(guān)，斜率的絕對值與熒光曲線間距相同，擴增效率計算式為E＝10-1/斜率，如果將擴增效率用百分率來表示，則E%=(E-1)×100%。一般說來，擴增效率接近 100%是重復(fù)性好的標志，然而在實際操作時，擴增效率應(yīng)該在90%-105%之間，如果擴增效率低，可能的原因是引物設(shè)計不當(dāng)，或者反應(yīng)條件未優(yōu)化；若擴增效率大于100%，可能由于稀釋樣品加樣錯誤，或者有非特異性產(chǎn)物擴增，如引物二聚體產(chǎn)生。 
21.內(nèi)參（Internal
reference）在同一反應(yīng)中作為靶序列擴增，并用不同的探針進行雙重PCR檢測的對照序列。22.內(nèi)參基因（Reference
gene）內(nèi)源性參比基因的表達水平在樣品間不存在差異，如管家基因（Housekeeping
genes, HKGs），常用GAPDH、β-actin 、18SrRNA和28S rRNA等。相對定量中使用的參比樣品，用與其他樣品進行比較，確定某一基因的相對表達水平。24.陽性對照（Positive
Control）用已知量模板作對照，通常用來檢查引物工作是否正常，以及反應(yīng)程序是否正確設(shè)置。25.陰性對照（Negative
Control）重要的陰性對照包括無模板對照（No template control，NTC）和無反轉(zhuǎn)錄酶對照（No reverse transcriptase
control，NRC）。NTC：包含除模板之外的所有擴增反應(yīng)所必要組分的對照反應(yīng)，模板通常用水代替，用于檢測試劑污染或外源DNA造成的污染；NRC：在反轉(zhuǎn)錄的時候多配制一個體系，不加反轉(zhuǎn)錄酶，其余成分正常添加，在相同的反轉(zhuǎn)錄過程下獲得的產(chǎn)物，以此為模板，觀察擴增情況，用于檢驗cDNA中是否有基因組DNA的污染。
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| 詳情
| | 單標熒光探針 | FAM、VIC、HEX、TET、ROX、JOE、Cy3、CY5、TAMRA、Texas Red等 | | 雙標熒光探針 | 熒光基團：FAM、VIC、HEX、ROX、Cy3、Cy5、NED等 淬滅基團：MGB、BHQ、TAMARA系列等 | | 特殊單標熒光探針 | 地高辛Dig、磷酸Phosphorylation、生物素Biotin等 | | 修飾 | 硫代修飾、氨基修飾、巰基修飾、稀有堿基等 |
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參考文獻： [1]https://www./cn/zh/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-learning-center/real-time-pcr-basics/essentials-real-time-pcr.html； [2] https://zhuanlan.zhihu.com/p/388534929 [3]
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