前言

文章題目：Single-cell analysis of human primary prostate cancer reveals the heterogeneity of tumor-associated epithelial cell states
日期：2021-08-19
期刊：Nature Communications
DOI：https:///10.1038/s41467-021-27322-4

摘要

前列腺由多種細胞類型組成，包括上皮細胞、基質(zhì)細胞和免疫細胞，每種細胞都有專門的基因表達譜。前列腺癌是全球男性第二常見的惡性腫瘤，由腫瘤細胞和非腫瘤細胞類型混合而成。

為了表征前列腺癌腫瘤微環(huán)境，作者對來自局部前列腺癌患者的前列腺活檢、前列腺切除術標本和患者衍生的類器官進行單細胞 RNA 測序。發(fā)現(xiàn)了前列腺上皮細胞中的異質(zhì)細胞狀態(tài)，這些細胞狀態(tài)以富含前列腺癌的高雄激素信號狀態(tài)為標志，并確定了可能與前列腺癌發(fā)生相關的腫瘤相關細胞群。ERG陰性腫瘤細胞，與ERG相比陽性細胞，表現(xiàn)出與周圍腔上皮細胞共有的異質(zhì)性，似乎會引起常見的腫瘤微環(huán)境反應。前列腺上皮類器官具有與腫瘤相關的上皮細胞狀態(tài)，并且富含來自其母體組織的不同細胞類型和狀態(tài)。

局部前列腺癌中主要細胞類型的鑒定

從患有局部前列腺癌的男性的經(jīng)直腸前列腺活檢和根治性前列腺切除術（RP）標本中獲得了前列腺癌組織【N = 11 名患者，其中活檢患者（N = 3）、RP 腫瘤標本（N = 8）】和 RP 配對正常組織（N = 4），使用改進的 Seq-well 單細胞平臺分離單細胞用于 scRNA-seq，總共得到 21,743 個細胞，并鑒定了總共 9種不同的主要細胞類型。

細胞被注釋為上皮細胞、基質(zhì)細胞（內(nèi)皮細胞、成纖維細胞和平滑?。┖兔庖呒毎═ 細胞、骨髓細胞、漿細胞、肥大細胞和 B 細胞）

• 基于管腔上皮 (LE) 標志物KLK3、ACPP和MSMB的表達鑒定上皮細胞 ( N ?= 13,322)
• 基于PTPRC的高水平表達鑒定免疫細胞在五個簇中，其中一個簇以IL7R、CD8A和CD69的高水平表達為標志，表明 CD8 和 CD4 T 細胞的混合物；第二個簇的特征是骨髓細胞標志物APOE、LYZ和IL1B；第三個PTPRC+ 簇代表以MZB1和IGJ?高水平表達為標志的漿細胞。其余兩個PTPRC+ 簇被注釋為表達CPA3、KIT和TPSAB1的肥大細胞，以及表達MS4A1、CD22和CD79A的 B 細胞群
• 基質(zhì)細胞由以CLDN5和SELE表達為特征的內(nèi)皮細胞、表達C1S 、DCN和C7的成纖維細胞以及表達ACTA2、MYH11和RGS5 的平滑肌細胞組成

在每個樣本中捕獲了所有主要細胞類型，其中上皮細胞構成了最大的群體

利用上皮細胞揭示腫瘤細胞和周圍的非腫瘤上皮細胞異質(zhì)性

上皮細胞又繼續(xù)使用UMAP細分為20個亞群

• 具有KRT5、KRT15、KRT17和TP63表達的簇和顯著上調(diào)的基底上皮 (BE) 特征評分被確定為 BE 細胞
• 鑒于腫瘤細胞主要表達 LE 細胞標志物，如KLK2、KLK3、ACPP和NKX3-1，具有高 LE 特征評分的簇可能是腫瘤細胞或非惡性 LE 細胞
• BE 和 LE 特征圖還揭示了一個細胞簇（c5），稱為其他上皮（OE）細胞

除了這三種主要類型的上皮細胞外，接下來的目標是識別腫瘤細胞。來自歐洲血統(tǒng)患者的大約 50% 的 PCa 腫瘤具有TMPRSS2-ERG融合事件，并且較少發(fā)生其他 ETS 融合事件（ETV1、ETV4、ETV5）。因此，測試了細胞的ERG、ETV1、ETV4或ETV5表達，分別標記為ERG - 陰性（ERG-) 和陽性（ERG+)腫瘤細胞

之后又看了每種細胞類型的前十個marker gene

• BE 細胞顯示出已建立的基底上皮細胞標志物KRT5、KRT15和KRT17的高表達
• OE 細胞中的生物標志物是PSCA、PIGR、MMP7、SCGB1A1和LTF，其中PSCA在 PCa中上調(diào)，而SCGB1A1是肺棒狀細胞的標志物
• ERG+ 和ERG? 腫瘤細胞和非惡性LE細胞均表現(xiàn)出高表達的管腔標志物KLK3、KLK2和ACPP
• ERG+ 腫瘤細胞的特征在于ERG和腫瘤標志物PCA3、AMACR和TRPM8 的表達
• ERG- 腫瘤細胞以腫瘤標志物PCA3和TRPM8為標志

前人正常人前列腺的研究報告了兩種其他上皮細胞群：以KRT13、SERPINB1、CLDN4和APOBEC2表達為特征的hillock細胞和以SCGB3A1、PIGR、MMP7、CP和LCN2表達為特征的club細胞。這里發(fā)現(xiàn)OE和club細胞的特征基因表達存在很大重合，因此這里將OE命名為club cell

研究PCa的club細胞

PCa 中的club細胞以前沒有報道過。由于僅在 PCa 樣本中捕獲了club細胞而不是hillock細胞，于是假設club細胞可能與致癌作用有關，并且 PCa 的club細胞可能在某些細胞狀態(tài)下富集。

為了檢驗這一假設，作者將前列腺癌club細胞 (Club PCa) 與先前研究中的健康對照(Club Normal) 正常club細胞相結合，發(fā)現(xiàn)PCa club細胞表現(xiàn)出脂質(zhì)運載蛋白 2 ( LCN2）和生長抑制細胞因子SCGB3A1的下調(diào)；LTF 、 AR和AR下游成員（包括KLK3、KLK2、ACPP和NKX3-1 ）的上調(diào)，可能由其中特定狀態(tài)的club細胞驅(qū)動。

之后又將混合的細胞分成6群，c 0 中最顯著上調(diào)的基因組是 Hallmark 雄激素反應途徑，對應了c 0 中下游AR通路基因的上調(diào)。

ERG+ 和ERG- 腫瘤細胞的比較

分別分析了ERG+ 和ERG- 腫瘤細胞類型的結構區(qū)別，以識別不同的潛在細胞狀態(tài)。ERG+ 腫瘤細胞以患者特異性方式聚集，而 ERG- 腫瘤細胞沒有觀察到這種模式，因為大多數(shù)ERG- 腫瘤細胞狀態(tài)包含超過一名患者。

ERG+ 和ERG- 腫瘤細胞之間的轉(zhuǎn)錄差異表明它們可能在腫瘤微環(huán)境中引起不同的反應。為了鑒定腫瘤相關免疫細胞以及特定免疫細胞類型是否在ERG+ 或ERG- 樣本中差異富集，分析了 T 細胞群并鑒定了 CD4 和 CD8 T 細胞、調(diào)節(jié)性 T 細胞 (Treg) 和基于差異表達基因的NK細胞。

根據(jù)患者的ERG狀態(tài)對基質(zhì)細胞進行分群，并確定了三個不同的群體，包括內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞，在這三種基質(zhì)細胞類型中，成纖維細胞在ERG+ 患者中顯示出富集

ERG- 患者中 14 種常見的上調(diào)基因包括 Reactome PD-1 和Reactome的干擾素-γ 信號傳導基因家族，據(jù)報道它們都在晚期前列腺癌中上調(diào)，并且發(fā)現(xiàn)與ERG+ 細胞群相比， ERG- 患者富集的 CD4 T 細胞、腫瘤細胞和基質(zhì)細胞的 HLA 基因家族的表達量更高