心力衰竭和缺血性冠狀動(dòng)脈疾病仍然是全世界發(fā)病率和死亡率最普遍的原因。盡管傳統(tǒng)心臟護(hù)理的進(jìn)步大大降低了冠心病和急性心肌梗死的死亡率，然而，心力衰竭的患病率在老齡化人口中持續(xù)增加，這具有深遠(yuǎn)的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)后果。使用腺相關(guān)病毒(AAV)載體的心臟基因治療正在成為解決這一迫切臨床需求的潛在模式。

在廣泛的臨床前研究和早期臨床試驗(yàn)中顯示出最初的希望后，令人失望的大規(guī)模臨床試驗(yàn)結(jié)果破壞了AAV介導(dǎo)的心臟基因治療的進(jìn)展。然而，近年來，從以前的失敗中獲得的經(jīng)驗(yàn)加上靶向基因遞送的發(fā)展似乎已經(jīng)為心臟AAV基因治療的新前沿奠定了基礎(chǔ)，這一現(xiàn)狀或?qū)⒌玫酱蚱?。本文將就目前使用AAV進(jìn)行心臟治療臨床現(xiàn)狀和面臨的挑戰(zhàn)和有效性制約進(jìn)行綜述。

最早關(guān)于心臟靶向的AAV臨床實(shí)驗(yàn)起始于20世紀(jì)末。那時(shí)主要針對(duì)心臟血管生成的基因治療主要采用了質(zhì)粒DNA和腺病毒這兩種遞送方式。促進(jìn)血管生長的基因如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)和肝細(xì)胞生長因子(HGF)的靶向遞送在臨床前和早期臨床試驗(yàn)中顯示出有希望的療效，但較大的后期試驗(yàn)大多未能顯示出一致的益處。這些試驗(yàn)都沒有導(dǎo)致常規(guī)臨床治療的改變。而隨著AAVs的出現(xiàn)，關(guān)于心臟的基因治療主要轉(zhuǎn)向了這種載體。

使用AAV治療心臟的臨床開始于Roger J. Hajjar博士領(lǐng)導(dǎo)的使用AAV1遞送SERCA2a。

Roger J. Hajjar博士

SERCA2a基因過表達(dá)可增強(qiáng)肌漿網(wǎng)鈣泵逆濃度梯度重?cái)z取心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子，從而改善心肌高鈣環(huán)境。在廣泛小動(dòng)物，大動(dòng)物，體外的臨床實(shí)驗(yàn)中，AAV1-SERCA2a均證明了AAV1改善了心肌收縮性。然而，2007年在患者中開展的I/II a期試驗(yàn)CUPID卻并不如人意。盡管早期試驗(yàn)證明有臨床事件減少，但2015年隨后發(fā)布的臨床數(shù)據(jù)表明，AAV1/SERCA2a在測試劑量下并未改善心力衰竭和射血分?jǐn)?shù)降低患者的臨床進(jìn)程。臨床也隨之終止。

此次失敗對(duì)于AAV心臟治療打擊無疑是巨大的，在那之后直到2019年關(guān)于AAVs治療心臟的臨床試驗(yàn)才正式重啟。

由Asklepios公司（于2020年被拜耳收購）贊助的臨床試驗(yàn)NAN-101于2019年11月開始，目前正在檢測基于嵌合AAV (BNP116)的蛋白磷酸酶抑制劑1基因遞送對(duì)于充血性心力衰竭患者的效果。（NCT04179643）

此外，與心臟的相關(guān)的肌肉病（罕見?。┑难芯恳苍谶M(jìn)行中。

例如Danon Disease和杜氏肌肉營養(yǎng)不良癥（DMD）就是其中典型，其中Danon 是一種X連鎖顯性遺傳病，患者由于溶酶體相關(guān)膜蛋白2（LAMP2）基因突變，導(dǎo)致骨骼肌和心肌減弱，以致多器官障礙，最終因嚴(yán)重心力衰竭死亡。Rocket Pharmaceuticals在2019年4月開展了一項(xiàng)利用AAV9-LAMP2B基因遞送治療男性Danon病患者的臨床試驗(yàn)（NCT03882437），并通過靜脈注射，進(jìn)行全身注射。

此外，還有兩項(xiàng)關(guān)于杜氏肌肉營養(yǎng)不良癥（DMD）的臨床，IGNITE DMD（NCT03368742)和PF-06939926（NCT03362502）也采用了AAV9，另有一項(xiàng)關(guān)于DMD的臨床采用了AAVrh74的臨床臨床試驗(yàn)SRP-9001-102。

IGNITE DMD（NCT03368742)是由Solid Biosciences開展的一項(xiàng)研究，使用AAV9將合成dystrophin的基因（microdystrophin）遞送給DMD患者身體。

PF-06939926（NCT03362502）是由輝瑞公司開展的一項(xiàng)研究，為15名患者提供迷你肌營養(yǎng)不良蛋白。輝瑞試驗(yàn)報(bào)告了肌肉基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和功能改善的積極結(jié)果，但在心臟功能方面，臨床卻遇到了挫折。三例患者在接受fordadistrogene movaparvovec治療后出現(xiàn)了嚴(yán)重的肌無力不良事件，其中兩起涉及心肌炎，并歸因于研究藥物。輝瑞的外部數(shù)據(jù)監(jiān)察委員會(huì)審查了研究中的安全性發(fā)現(xiàn)，并且得出結(jié)論認(rèn)為，在接受治療后抗肌萎縮蛋白的某些突變可能與這些不良事件相關(guān)。

由此，輝瑞決定新的臨床研究方案將排除具有外顯子9至13突變（外顯子缺失，復(fù)制，插入或點(diǎn)突變）或外顯子29和30缺失的DMD患者。

IGNITE DMD臨床也遭遇了相似的問題，由于接受治療的患者出現(xiàn)與治療相關(guān)的嚴(yán)重不良事件，使得2020年該試驗(yàn)暫停了一年，直到21年改變了臨床方案才得以繼續(xù)。

Sarepta Therapeutics公司的SRP-9001-102在安全性方面相比前兩者似乎更有保證，但在有效性方面來看，目前似乎只有輕微療效。

AAV心臟靶向的失敗分析及盡管許多目前的臨床試驗(yàn)失敗原因仍然需要調(diào)查，但已公布的信息或許能提供一個(gè)合理的概覽。

在前文提到的AAV1-SERCA2a臨床試驗(yàn)中，研究人員檢查了不幸死亡或接受心臟移植的受試者的心臟。出乎意料的是，在分析的組織中幾乎沒有發(fā)現(xiàn)病毒載體基因組，這表明基因轉(zhuǎn)導(dǎo)有缺陷，而不是轉(zhuǎn)基因功能無效，這一結(jié)果表明，遞送問題仍然是AAV的首要需要解決的問題。

此外，在其他關(guān)于AAV的共性問題方面，AAV血清型、啟動(dòng)子和人類心臟遞送方法的最佳組合仍待摸索，患者本身具有AAV具有中和抗體，AAV本身的高成本，臨床過程中服用抗免疫藥物的影響，難以評(píng)估體內(nèi)AAV的轉(zhuǎn)基因表達(dá)量，治療前難以檢測目標(biāo)基因表達(dá)的降低等問題都是AAV心臟治療的制約難題。

心臟AAV基因治療的臨床療效受多種因素影響，但可分為3大類:調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的因素、與AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)基因相關(guān)的因素和與基因治療接受者相關(guān)的因素。

調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的因素

基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率是決定基因治療成功與否的關(guān)鍵參數(shù)。重要的是，在臨床試驗(yàn)中對(duì)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率進(jìn)行一致的評(píng)估極具挑戰(zhàn)性，因?yàn)樾呐K組織不容易獲得，并且目前沒有建立非侵入性追蹤轉(zhuǎn)基因表達(dá)的方法。與功能基因評(píng)估相比，上市前生產(chǎn)測試研究的心臟轉(zhuǎn)導(dǎo)功效表征通常不太廣泛，通常僅限于劑量測定研究。

調(diào)節(jié)心臟基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵因素包括載體、劑量和遞送方法。這些因素是相互關(guān)聯(lián)的，它們的最佳組合也可能取決于目標(biāo)疾病、轉(zhuǎn)基因和研究的動(dòng)物物種。

例如，AAV血清型的嗜性可能因輸送途徑而異。血管內(nèi)給藥后，內(nèi)皮屏障可能更多地抑制某些血清型的轉(zhuǎn)導(dǎo)。盡管在嚙齒動(dòng)物研究中顯示AAV9是最強(qiáng)的心臟調(diào)節(jié)因子，使用直接注射AAVs的大型動(dòng)物研究通常顯示使用AAV6是最強(qiáng)的心臟血清型調(diào)節(jié)因子。這是否是由于分娩方式或動(dòng)物種類的差異仍不清楚。值得注意的是，盡管直接心肌內(nèi)注射克服了內(nèi)皮屏障，但基因表達(dá)的分布通常僅在注射部位周圍。

給定載體的有效劑量也可能受給藥方法的影響。啟動(dòng)子的選擇是調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的另一個(gè)重要因素。AAV劑量和基因表達(dá)的關(guān)系會(huì)受到啟動(dòng)子效率的影響。然而，這種相互作用在人類心臟中的運(yùn)作方式仍然未知，即使是常用的啟動(dòng)子。使用MRI或心內(nèi)膜心肌活檢進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)分析的新臨床研究可能會(huì)提高研究人員對(duì)這些因素的理解。

最后，基因遞送方法也可以影響基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和分布。目前的AAV基因治療技術(shù)不允許100%的心臟轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且在基因遞送后可以看到不同程度的異質(zhì)性，其分布很大程度上受遞送方法的影響。對(duì)于治療效果，心臟中必須被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的百分比可能取決于治療基因。

與AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)基因相關(guān)的因素

這些因素與轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的功能和宿主對(duì)轉(zhuǎn)基因的免疫反應(yīng)有關(guān)。顯然，遞送到心臟的基因需要對(duì)人類疾病有治療作用。

通常來說，轉(zhuǎn)基因的功能在進(jìn)入臨床試驗(yàn)之前已經(jīng)被很好地表征，并且基因轉(zhuǎn)移的有效性和安全性得到臨床前研究的支持。然而，動(dòng)物模型在提供關(guān)于載體免疫反應(yīng)性的可翻譯信息方面能力有限。此外，人和動(dòng)物之間細(xì)胞內(nèi)信號(hào)和蛋白質(zhì)功能/相互作用的差異可能會(huì)導(dǎo)致臨床前研究中未發(fā)現(xiàn)的意外影響。

值得注意的是，改變心臟細(xì)胞的細(xì)胞特性也可能影響心臟的電生理特性，并導(dǎo)致心律失常增加。對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的免疫反應(yīng)也可能導(dǎo)致心律不齊。然而，在動(dòng)物模型中檢測心律失?？赡芎芾щy，因?yàn)樾穆墒С１O(jiān)測器并不總是植入體內(nèi)。又因?yàn)榕R床前研究往往持續(xù)時(shí)間相對(duì)較短，可能無法識(shí)別長期影響。

此外，非靶器官中的基因表達(dá)也可以誘導(dǎo)意外的效應(yīng)。如上所述，在臨床研究中缺乏成功的心臟基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的證據(jù)，排除了對(duì)轉(zhuǎn)基因功能在人類中是否無效的評(píng)估。

與基因治療接受者相關(guān)的因素

基因治療的基本概念是通過在疾病環(huán)境中補(bǔ)充內(nèi)源性低表達(dá)基因或抑制高活性基因來干預(yù)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)過程。這對(duì)于遺傳性疾病來說很簡單，因?yàn)槿藗冎纼?nèi)源性基因缺失或有缺陷。與之相反的是，當(dāng)靶向更普遍的疾病如心力衰竭時(shí)，基因治療的基本原理依賴于基于先前研究的靶基因的內(nèi)源性表達(dá)低(或高)的假設(shè)。

然而，確認(rèn)在心臟中基因表達(dá)水平是具有挑戰(zhàn)性的，并且特定患者的實(shí)際蛋白水平可能沒有失調(diào)。在這種類型的患者中，將某種基因的表達(dá)從正常增加到高水平可能沒有太大益處。

這可能是CUPID試驗(yàn)中SERCA2a基因治療的情況，因?yàn)檩^溫和的患者群體被納入后期研究(NYHA II級(jí))，與早期試驗(yàn)中較嚴(yán)重的患者群體(NYHA III-IV級(jí))形成對(duì)比。

而有限的證據(jù)表明，NYHA II類患者內(nèi)源性SERCA2a表達(dá)較低，這凸顯了該臨床研究有待精心設(shè)計(jì)的重要性。這一差異可能使得試驗(yàn)結(jié)果不具有普遍性。

對(duì)于基因補(bǔ)充療法，應(yīng)該考慮相對(duì)于通過基因轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得的基因表達(dá)水平的內(nèi)源表達(dá)的豐度。根據(jù)現(xiàn)有內(nèi)源基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的豐度，相同程度的過量表達(dá)可能導(dǎo)致10倍或少量增加。

與受體(患者心臟)相關(guān)的其他因素包括AAV遞送期間和之后的免疫反應(yīng)以及心臟病的類型。無論是急性還是慢性的免疫反應(yīng)，免疫反應(yīng)都通常會(huì)使基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的效力最小化。在沒有剩余AAV能夠在心肌存活的情況下，伴有大面積梗死的心力衰竭患者可能不會(huì)受益于旨在改善心肌細(xì)胞功能的基因治療。

參考來源：

1.Yamada KP, Tharakan S, Ishikawa K. Consideration of clinical translation of cardiac AAV gene therapy. Cell Gene Ther Insights. 2020 Jun;6(5):609-615. doi: 10.18609/cgti.2020.073. Epub 2020 May 14. PMID: 32774893; PMCID: PMC7406214.

2.Hulot JS, Ishikawa K, Hajjar RJ. Gene therapy for the treatment of heart failure: promise postponed. Eur Heart J. 2016 Jun 1;37(21):1651-8. doi: 10.1093/eurheartj/ehw019. Epub 2016 Feb 27. PMID: 26922809; PMCID: PMC4887702.