北京腦科學(xué)與類腦研究中心（CIBR）熊巍實(shí)驗(yàn)室在 Cell 子刊 Cell Reports 上發(fā)表了題為：Template-independent genome editing in the Pcdh15 av-3j mouse, a model of human DFNB23 nonsyndromic deafness（不依賴于修復(fù)模板的基因編輯應(yīng)用于Pcdh15^av-3j小鼠品系，一個人類非綜合性耳聾DFNB23的動物模型）。

首次在哺乳動物模型上展示了利用非同源末端連接（NHEJ）的基因修復(fù)通路有效實(shí)現(xiàn)先天性遺傳疾病的在體基因治療。

DNA水平基因修復(fù)成為下一代基因治療新方向

基因治療是治療基因突變導(dǎo)致的遺傳性疾病的金鑰匙，目前大部分工作集中在針對mRNA的基因替代（Gene replacement）或者基因沉默（Gene silence），若干適用性好的靶基因已經(jīng)被用于臨床，體現(xiàn)出基因治療的可行性。然而就中心法則而言，在mRNA水平的修復(fù)還是治標(biāo)不治本，因此針對DNA的基因修復(fù)代表了下一代基因治療的新方向，本研究提出特別針對DNA移碼突變的一個方案，并系統(tǒng)展示了在耳蝸毛細(xì)胞DNA水平的基因編輯有效恢復(fù)動物聽覺。

DNA水平的基因修復(fù)是以CRISPR-Cas為代表的基因編輯技術(shù)來實(shí)現(xiàn)，隨著2011年CRISPR-Cas工具的開發(fā)成熟，研究者可以依賴guide RNA（gRNA）實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定可控的定點(diǎn)DNA雙鏈切割/斷裂（DSB），CRISPR-Cas技術(shù)的一個重要應(yīng)用就是實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)切除致病突變。DSB的修復(fù)有諸多通路，其中最主要的是NHEJ和同源重組修復(fù)（HDR）兩種：NHEJ產(chǎn)物攜帶各種插入或者缺失（InDel）導(dǎo)致的移碼突變，其結(jié)果等同于從一個突變到多種突變，因此沒有得到基因治療的很好應(yīng)用；依賴HDR修復(fù)通路將靶基因修復(fù)為野生型，但是這一過程需要有一個野生型的DNA模板，然而在體情況下基于HDR通路的修復(fù)效率在活體動物的終端分化細(xì)胞上效率非常低，從一定程度上限制了基因編輯在基因治療上的應(yīng)用。因此基于基因編輯技術(shù)的在體基因治療方案一直處于實(shí)驗(yàn)室和細(xì)胞系體系研究階段。

首次在哺乳動物模型上展示了利用NHEJ基因修復(fù)通路實(shí)現(xiàn)先天性遺傳疾病的在體基因治療

自2016年以來，陸續(xù)有基于細(xì)胞系的研究表明gRNA-spCas9酶切割產(chǎn)生的DSB的末端連接產(chǎn)物并非隨機(jī)，而是可以預(yù)測和重復(fù)實(shí)現(xiàn)的，那么基于這一原理，對于某一個gRNA所獲得DNA編輯事件可以預(yù)測，反過來說可以根據(jù)DNA產(chǎn)物需要來選擇gRNA。然而這一規(guī)律在體內(nèi)的實(shí)際情況是怎么樣的并不知道，該研究即利用小鼠耳蝸培養(yǎng)組織驗(yàn)證了終端分化的功能細(xì)胞上編輯產(chǎn)物也具有可重復(fù)性，并利用該原理實(shí)現(xiàn)了單個gRNA即可修復(fù)移碼突變，實(shí)現(xiàn)小鼠的在體基因治療。

本研究展示了接收聲音振動的聽覺毛細(xì)胞可以利用內(nèi)源性DNA修復(fù)通路中的最主要方式NHEJ（大于90%）修復(fù)InDel導(dǎo)致的移碼突變，在遺傳性耳聾動物模型（Pcdh15^av-3j小鼠，攜帶一個腺苷的插入突變）上實(shí)現(xiàn)了導(dǎo)入單個gRNA有效修復(fù)該插入導(dǎo)致的遺傳性耳聾，而PCDH15蛋白是毛細(xì)胞tip link的組分，是毛細(xì)胞機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)通道開放的關(guān)鍵蛋白，蛋白質(zhì)量有215kD之巨。該概念的成功驗(yàn)證提示占人類22%的移碼突變導(dǎo)致的遺傳性疾病有廣闊的治療前景。

從體外組織和在體動物兩個層面展示通過NHEJ通路實(shí)現(xiàn)移碼突變的修復(fù)以及聽覺和平衡覺功能的部分修復(fù)

熊巍實(shí)驗(yàn)室長期研究耳聾相關(guān)基因的生理和病理機(jī)制，本工作利用一株模擬人類DFNB23遺傳性耳聾的Pcdh15^av-3j小鼠品系，全方位系統(tǒng)的展示了突變位點(diǎn)附近產(chǎn)生的DSB可以通過NHEJ通路實(shí)現(xiàn)移碼突變的修復(fù)以及聽覺和平衡覺功能的部分修復(fù)。本研究在體外組織和在體動物兩個層面，從編輯基因產(chǎn)物、蛋白表達(dá)、毛細(xì)胞功能、以及動物生理功能等多個角度的分析和評估來展現(xiàn)該方案的可行性。

組織層面：

耳蝸毛細(xì)胞的基因遞送一直是一個難點(diǎn)，熊巍博士早前開發(fā)了一套耳蝸組織培養(yǎng)和基因電轉(zhuǎn)遞送的系統(tǒng)解決方案（Xiong et al., Nat. Protoc. 2014），實(shí)現(xiàn)在培養(yǎng)的耳蝸組織上通過電轉(zhuǎn)（較大規(guī)模）向毛細(xì)胞導(dǎo)入外源基因，后續(xù)通過電生理或者鈣成像研究特定基因干預(yù)后的毛細(xì)胞功能變化?；谠摱侂娹D(zhuǎn)技術(shù)，熊巍實(shí)驗(yàn)室首先掃描了av-3j突變（1bp插入）上下游15bp的區(qū)域內(nèi)的4條gRNA所產(chǎn)生的編輯產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)其中的m-3j-gRNA1表現(xiàn)出高比例的1bp刪除的編輯產(chǎn)物，而且重復(fù)性很高，意味著m-3j-gRNA1是一個潛在的治療av-3j突變的備選gRNA。在培養(yǎng)的Pcdh15^av-3j耳蝸組織上，通過電轉(zhuǎn)表達(dá)了spCas9和m-3j-gRNA1的Pcdh15^av-3j毛細(xì)胞可以恢復(fù)PCDH15蛋白的表達(dá)（Pcdh15^av-3j突變導(dǎo)致PCDH15不表達(dá)上膜），同時Pcdh15^av-3j毛細(xì)胞的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)功能也有所恢復(fù)。有意思的是，在包括-1bp、-4bp、+2bp等在內(nèi)的回碼（frame-restored）產(chǎn)物類別中，其最高占比產(chǎn)物均對PCDH15功能有明顯恢復(fù)，提示蛋白修復(fù)產(chǎn)物在非保守區(qū)即使1-2氨基酸的插入或者刪除并非絕對無功能，從轉(zhuǎn)化角度考慮也是值得去開發(fā)的一種可能性。

在體層面：

根據(jù)體外研究的效果，熊巍實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步對Pcdh15^av-3j小鼠在體耳蝸?zhàn)⑸浒衜-3j-gRNA1的AAV2/9。通過對電轉(zhuǎn)耳蝸組織（體外）和病毒注射耳蝸組織（在體）的基因編輯產(chǎn)物進(jìn)行的系統(tǒng)比對，發(fā)現(xiàn)它們無論是在主編輯產(chǎn)物還是產(chǎn)物的比例上均非常一致。進(jìn)一步的對m-3j-gRNA1病毒注射小鼠的各方面指標(biāo)的評估，包括耳蝸毛細(xì)胞的PCDH15表達(dá)（蛋白表達(dá)）、耳蝸毛細(xì)胞的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)電流（細(xì)胞功能）、小鼠的聽性腦干電位（ABR，聽覺生理）和驚嚇反應(yīng)（Startle，行為學(xué)）等，均顯示單個m-3j-gRNA1在spCas9的幫助下即可實(shí)現(xiàn)av3j突變的功能性恢復(fù)。熊巍實(shí)驗(yàn)室同時也檢驗(yàn)了前庭器官的恢復(fù)效果，結(jié)果顯示Pcdh15^av-3j小鼠在注射m-3j-gRNA1后也得到了平衡功能的恢復(fù)。

為基于基因編輯技術(shù)的在體基因治療提供進(jìn)一步支持

基因藥是繼化學(xué)藥之后的基礎(chǔ)和臨床各機(jī)構(gòu)研發(fā)的下一代藥物的重點(diǎn)方向，在人體基因遞送和基因表達(dá)等技術(shù)門檻陸續(xù)解決的情況下，遺傳性疾病的基因治療的前景越來越明確。2012年CRISPR-Cas技術(shù)的橫空出世，提供了有效且實(shí)用的DNA編輯工具，讓面向DNA的在體基因治療成為可能?；瘜W(xué)藥和基因替代/沉默等手段通常只能做到治標(biāo)不治本，而面向DNA的基因編輯帶來的基因修復(fù)，可以讓被修復(fù)基因跟隨生命體的生長節(jié)奏在時間上和空間上實(shí)現(xiàn)內(nèi)源表達(dá)調(diào)控，是最自然的基因表達(dá)和調(diào)控的體現(xiàn)，也應(yīng)該是最理想的針對遺傳性疾病的修復(fù)方式。

研究歷程

熊巍實(shí)驗(yàn)室在2015年建立實(shí)驗(yàn)室之時即確立了研究遺傳性耳聾基因治療的方向，所有的技術(shù)和資源都是從零開始積累，期間嘗試了多種策略和方法，最終鎖定利用到NHEJ的非隨機(jī)修復(fù)機(jī)制來重塑移碼突變導(dǎo)致的致聾突變。本工作從2019年底投稿到2022年上半年最終接收，歷時2年半，不可謂不艱難，不過“凡是過去，皆為序章”！

該論文的共同第一作者為劉戀、鄒林志和李寬三位博士研究生，本工作也得到南方科技大學(xué)陳放怡實(shí)驗(yàn)室、山東大學(xué)徐志剛實(shí)驗(yàn)室和清華大學(xué)孫前文實(shí)驗(yàn)室的大力協(xié)助，論文通訊作者為熊巍。