01

試驗中使用的20種氨基酸，包括Val、Leu、異亮氨酸（Isoleucine，Ile）、脯氨酸（Proline，Pro）、丙氨酸（Alanine，Ala）、甲硫氨酸（Methionine，Met）、甘氨酸（Glycine，Gly）、蘇氨酸（Threonine，Thr）、組氨酸（Histidine，His）、天冬氨酸（Aspartate，Asp）、酪氨酸（Tyrosine，Tyr）、谷氨酸（Glutamicacid，Glu）、賴氨酸（Lysine，Lys）、谷氨酰胺（Glutamine，Gln）、天冬酰胺（Asparagine，Asn）、色氨酸（Tryptophan，Trp）、苯丙氨酸（Phenylalanine，Phe）、精氨酸（Arginine，Arg）、半胱氨酸（Cysteine，Cys）、絲氨酸（Serine，Ser）均為色譜純級，美國Sigma公司；4種SCFA：丁酸、戊酸、異戊酸、異丁酸均為色譜純級，美國Sigma公司；磷酸鹽緩沖液，生工生物股份有限公司；人結(jié)腸腺癌細胞（Caco-2），中科院上海生命科學(xué)研究院細胞庫；0.25%胰酶-EDTA消化液、青霉素-鏈霉素混合液，美國Gibco公司；DMEM培養(yǎng)基、PBS緩沖液、HBSS緩沖液，美國HyClone公司；細胞培養(yǎng)瓶、96孔板、Transwell培養(yǎng)板，美國Corning公司；胎牛血清（FBS），以色列BiologicalIndustries公司。高壓蒸汽滅菌鍋，上海博迅醫(yī)療生物儀器有限公司；分析天平，瑞士MettlerToledo公司；厭氧工作站，英國依萊泰科；GC2010plus氣相色譜儀，日本島津公司；DB-FFAP型氣相色譜柱（0.32mm×30m×0.5μm），美國Agilent公司；MX-307高速離心機，日本TOMY公司；超純水儀、細胞電阻儀，美國Millipore公司。

L8900氨基酸自動分析儀，日本日立公司；色譜柱為磺酸型陽離子樹脂柱，檢測波長570nm和440nm；THU-35C礱谷機，日本佐竹制作所；JNM-Ⅲ型碾米機，成都施特威科技發(fā)展公司；101型烘箱，上海索譜儀器有限公司；ME204E電子天平，梅特勒－托利多公司。

27例健康志愿者來自浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，男16人，女11人，年齡在20~55歲。所有志愿者有近3個月的正常飲食，在這3個月內(nèi)沒有服用抗生素或其它藥物，也沒有接受過益生菌治療。研究人員向受試者進行全面解釋，并給予受試者書面知情同意。收集志愿者的糞便樣本均在6h內(nèi)處理結(jié)束。取3g糞便樣本裝入取樣管中，加入30mL厭氧磷酸緩沖液（PBS）配制成體積分數(shù)10%的糞便懸液。用渦旋震蕩器（Vortex）充分振蕩使其混勻后，再用糞便處理器過濾除去糞便中未消化的大顆粒食物殘渣。

20種溶于水的培養(yǎng)基配制方法：100mgVal、Leu、Ile、Pro、Ala、Met、Gly、Thr、His、Asp、Tyr、Glu、Lys、Gln、Asn、Trp、Phe、Arg、Cys、Ser分別溶解于10mL超純水中，配制成10g/L的氨基酸培養(yǎng)基，500mg小牛血清蛋白BSA、NaCl分別溶于10mL超純水中，配制成50g/L的對照組溶液；2種微溶于水的氨基酸（Tyr、Asp）培養(yǎng)基配制方法：5mgAsp溶于1mL超純水中，配制成5mg/mLAsp培養(yǎng)基；1.25mgTyr溶于5mLPBS溶液中，配制0.25mg/mLTyr培養(yǎng)基。1.2.3體外發(fā)酵參照Zarling等[10]報道的體外發(fā)酵方法，使用前期報道過的批式發(fā)酵系統(tǒng)[18]。在厭氧工作站中，將滅菌的10mL西林瓶身上貼好22種培養(yǎng)基標簽。20種溶于水的培養(yǎng)基發(fā)酵方法：將100μL溶于水的20種培養(yǎng)基分裝到對應(yīng)培養(yǎng)基標簽的西林瓶中，接種3mL10%的糞便懸液，壓蓋。2種微溶于水的培養(yǎng)基發(fā)酵方法：將200μLAsp培養(yǎng)基分裝到對應(yīng)培養(yǎng)基標簽的西林瓶中，接種3mL10%的糞便懸液，壓蓋；稱量0.5g糞便，加入5mL0.25mg/mLTyr培養(yǎng)基，混勻并過濾，配制成10%Tyr/PBS糞便懸濁液，取3mL分裝到對應(yīng)培養(yǎng)基標簽的西林瓶中，壓蓋。所有西林瓶放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，在24h取樣。

氣相色譜檢測24h樣品中SCFA的濃度。試驗中，500μL發(fā)酵液樣品加入100μL巴豆酸，酸化24h，離心后取上清，經(jīng)過0.22μm水系過濾膜，上機。過濾液通過DB-FFAP型氣相色譜柱（0.32mm×30m×0.5μm），使用氫氣火焰離子化檢測器，以巴豆酸（反式-2-丁烯酸）作為內(nèi)標物，檢測乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸、戊酸。

將Caco-2細胞接種于培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)液為DMEM高糖（4.5g/L）培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%L-谷氨酰胺、青霉素100μg/mL、鏈霉素100μg/mL），置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱，每隔3~4d傳代1次，取對數(shù)生長期細胞作后續(xù)試驗。將狀態(tài)良好的細胞消化，吹打均勻，調(diào)節(jié)密度2×106個/mL，每孔加入2×105個細胞，同時在頂側(cè)（Apical，AP）與基底側(cè)（Basolateral，BL）加入不同SCFA（丁酸、異丁酸、異戊酸、戊酸）共同孵育72h，頂側(cè)與基底側(cè)的SCFA終濃度為2.5mmol/L。在孵育過程中的24，48，72h，測定不同SCFA（異丁酸、異戊酸、戊酸、丁酸）對Caco-2細胞的跨膜電阻值（TEER）的影響。

試驗數(shù)據(jù)通過SPSS軟件（IBMSPSSStatistics19.0軟件）先做方差齊性檢驗，判斷數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布。對不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)（即方差不齊性）采用Mann-WhitneyU檢驗；對符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)（即方差齊性）選擇ANOVA-LSD檢驗。計算得出不同氨基酸培養(yǎng)基與對照組的SCFA濃度的顯著性差異。T值采用雙總T檢驗中的獨立樣本檢驗計算，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)差異。

02

采用氣相色譜測定27名試驗參與者糞便中SCFA濃度結(jié)果見表1。

試驗采用氣相色譜測定24h樣品上清液中SCFA濃度。通過比較不同氨基酸培養(yǎng)基與對照組之間SCFA的含量(圖1)，研究發(fā)現(xiàn)在含有20種氨基酸的培養(yǎng)基中，乙酸、丙酸、丁酸的產(chǎn)量(圖1a~1c)與對照組沒有顯著差異，提示膳食中的氨基酸可能不參與結(jié)腸內(nèi)乙酸、丙酸和丁酸的代謝合成。然而，3種SCFA(異丁酸、異戊酸、戊酸）與對照組有顯著差異(圖1d~1f）。其中Val培養(yǎng)基中異丁酸含量明顯高于對照組(圖1d），且有極顯著性差異（t=15.4089，P=1×10-6<0.01）。Leu和Ile培養(yǎng)基中，異戊酸含量明顯高于對照組(圖1e)(Leu:t=15.3183,P=1×10-6<0.01;Ile:t=16.9307,P=1×10-6<0.01；BSA：t=4.0311，P=2.651×10-4<0.01)。Pro培養(yǎng)基中戊酸含量明顯高于對照組中的戊酸，且有極顯著差異（t=12.0208，P=3×10-6<0.01）(圖1f)。該結(jié)果表明，糞便中的乙酸、丙酸、丁酸不是由氨基酸降解形成；糞便中的異戊酸是由Leu、Ile降解形成；異丁酸是由Val代謝形成；戊酸是由Pro代謝產(chǎn)生。

腸道菌群代謝產(chǎn)生的短鏈脂肪酸對腸道細胞具有各種作用，其中一個重要的作用為增強腸道屏障[19]。本研究采用測定Caco-2細胞跨膜電阻值（TEER）來考察SCFA對腸屏障的影響，TEER越大表示通透性越差，腸屏障功能越好。結(jié)果顯示，與對照組相比，氨基酸代謝產(chǎn)生的SCFA中，戊酸能顯著提高Caco-2細胞跨膜電阻值（圖3a~3b），促進Caco-2細胞腸屏障的形成，與碳水化合物產(chǎn)生的丁酸類似，然而在相同濃度下，戊酸增強腸道屏障的能力較弱，需發(fā)酵48h后才有效果。已有許多研究表明丁酸可以促進腸屏障的形成[13]，而戊酸對腸屏障的影響未見報道。氨基酸產(chǎn)生的另外2種SCFA（異丁酸、異戊酸）會降低Caco-2細胞跨膜電阻值（圖3c~3d），抑制Caco-2細胞腸屏障的形成。Blakeney等[20]研究報道，異戊酸可引起結(jié)腸平滑肌松弛，從而抑制腸道屏障的形成，與本研究結(jié)果一致。

糞便中SCFA的含量和比例是人體健康的一個重要指標，可以直接反映腸道菌群的活性和平衡。例如，在正常飲食狀態(tài)下2型糖尿病患者糞便中乙酸和丁酸的含量顯著低于對照組的健康人群[21]。同時糞便SCFA含量和比例還受飲食結(jié)構(gòu)的影響。Giuditta等[22]發(fā)現(xiàn)與低熱量的地中海飲食模式相比，純素食飲食模式下糞便中乙酸和丁酸的含量下降，而異丁酸、異戊酸含量顯著增加。有報道指出健康人群糞便中碳水化合物產(chǎn)生的乙酸、丙酸和丁酸和蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生的戊酸、異戊酸和異丁酸的摩爾比值為95∶5到90∶10[23]。而本試驗組健康人群糞便中此物質(zhì)的摩爾比為93∶7，提示試驗參與者的膳食組成正常。而且乙酸、丙酸、丁酸之間的摩爾比值為67∶15∶11，基本符合65∶20∶15的比例，進一步提示試驗組人員腸道菌群代謝處于正常狀態(tài)。

人體腸道微生物降解氨基酸后主要代謝產(chǎn)物包括氨、生物胺、H2S和3種SCFA（異丁酸、異戊酸、戊酸），其中生物胺的研究已有較多報道[24-26]，然而對這3種SCFA（異丁酸、異戊酸、戊酸）的研究相抵比較少。Shen等[27]在2010年通過體外發(fā)酵模型對比研究了不同烹調(diào)方式下牛肉、雞肉和三文魚對人體腸道微生態(tài)和SCFA的影響，發(fā)現(xiàn)新鮮三文魚肉顯著影響到丁酸和異丁酸的產(chǎn)生。Zarling等[10]也是通過體外發(fā)酵試驗證實了異丁酸和異戊酸分別由Val和Leu降解形成。在本研究中，研究證實了氨基酸、蛋白質(zhì)食物組分在人體腸道中對乙酸、丙酸和丁酸的形成影響很小，然而直接影響戊酸、異戊酸和異丁酸的形成。除了Leu之外，腸道菌群發(fā)酵Ile也可以形成異戊酸；Val代謝產(chǎn)生異丁酸，而Pro代謝產(chǎn)生戊酸。

3種SCFA（異丁酸、異戊酸、戊酸）對人體健康的影響已有部分報道。例如，流行病學(xué)的證據(jù)表明戊酸和丁酸一樣對腸道健康有益[28-29]。還有研究發(fā)現(xiàn)與克羅恩病患者相比，健康人的糞便中含有更多產(chǎn)戊酸的細菌[29]。對老年人的研究發(fā)現(xiàn)，健康百歲老人的糞便中戊酸、丙酸與丁酸的濃度明顯升高[30]。Blakeney等[20]研究報道，異戊酸可引起結(jié)腸平滑肌松弛，從而抑制腸道屏障的形成。Yuille等[31]報道戊酸能夠像丁酸一樣，在體外細胞模型中作為組蛋白去乙酰化酶的抑制劑影響細胞的繁殖周期。因此，本研究中也利用體外細胞模型，比較了氨基酸代謝產(chǎn)物異丁酸、戊酸和異戊酸對細胞通透性的影響。研究發(fā)現(xiàn)只有戊酸能夠在體外增加Caco-2細胞腸屏障，而異戊酸和異丁酸降低Caco-2細胞腸屏障，并且在2.5mmol/L濃度下戊酸增強腸道屏障的能力稍弱于丁酸，丁酸增強腸道屏障已經(jīng)有眾多研究，其增強腸道屏障的機制主要通過激活A(yù)MPK介導(dǎo)緊密連接重組裝實現(xiàn)[32]，氨基酸代謝產(chǎn)物戊酸增強腸道屏障為首次發(fā)現(xiàn)，相關(guān)研究有待進一步探索，如其強腸道屏障的具體機理等，因其化學(xué)結(jié)構(gòu)與丁酸具有相似性，其機制可能也是通過激活A(yù)MPK介導(dǎo)緊密連接重組裝而實現(xiàn)。戊酸對人體健康的影響逐漸受到越來越多的關(guān)注。最近有報道戊酸通過T淋巴細胞和B淋巴細胞的代謝和表觀遺傳重編程發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用[33]，這些表明戊酸在人體健康中可能起正向作用。同時，本研究發(fā)現(xiàn)異丁酸、異戊酸能夠增加腸道通透性，在人體健康中可能起到反向作用。國外研究報道中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)糞便中異戊酸含量高與人體抑郁癥的發(fā)病有關(guān)[34]，結(jié)合本研究結(jié)果，提示異戊酸可能影響到腸粘膜的通透性，進而通過腦腸軸影響到與精神系統(tǒng)有關(guān)疾病的發(fā)生。本研究中這些對人體健康起不同作用的戊酸、異戊酸、異丁酸，在腸道菌中由特定的氨基酸發(fā)酵降解而成，因此高蛋白飲食經(jīng)腸道菌發(fā)酵后對人體健康的不同影響可能與其含不同的這些特定氨基酸有關(guān)。

總之，本研究利用體外發(fā)酵模型，探究了氨基酸作為底物對腸道微生物代謝產(chǎn)物 SCFA 產(chǎn)生的影響，填補了多年來在 3 種 SCFA（異丁酸、異戊酸、戊酸）底物研究上的空缺。同時采用測定細胞跨膜電阻值的方法， 比較了對人體上皮細胞通透性的影響。目前的研究雖然都采用體外模型，但是研究結(jié)果為今后進一步探究腸道菌群氨基酸代謝對機體健康狀態(tài)的影響奠定了基礎(chǔ)。

/ 摘自 /

中國食品學(xué)報

/ 責(zé)任編輯 /

張小芳 王欣  汪惠勤

柯李晶 高觀禎 朱立穎

浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院

浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與

風(fēng)險防控國家重點實驗室

浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護與微生物研究所

浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院