腫瘤的發(fā)生發(fā)展通常意味著局部組織的一些異常變化，比如復(fù)雜的基因突變，非自身蛋白的表達(dá)或自身蛋白的異常表達(dá)等。

類似病毒感染后細(xì)胞中的外來(lái)肽，腫瘤細(xì)胞也會(huì)將突變產(chǎn)生的新抗原通過(guò)MHC-I呈遞，這導(dǎo)致它們被CD8⁺T細(xì)胞識(shí)別，驅(qū)動(dòng)抗腫瘤免疫反應(yīng)[1]發(fā)生。如果把所有由MHC-I所呈遞的肽放在一起，它們通常被統(tǒng)稱為免疫肽組[2]。

目前，腫瘤免疫治療的關(guān)注度非常高，例如免疫檢查點(diǎn)抑制劑、免疫細(xì)胞過(guò)繼治療、新抗原疫苗等，MHC-I抗原呈遞的效率被證明能一定程度上解釋療效[3，4]；篩選或預(yù)測(cè)這些新抗原，將有助于腫瘤免疫療法的開(kāi)發(fā)。

實(shí)際上，許多蛋白質(zhì)組學(xué)、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)方法已被用于發(fā)現(xiàn)新抗原，但均僅限于體外研究或使用混合的腫瘤裂解物，并且缺乏腫瘤微環(huán)境或組織特異性刺激。因此，之前的研究并不能反應(yīng)腫瘤免疫肽組的全貌。

近日，來(lái)自麻省理工學(xué)院的Tyler Jacks團(tuán)隊(duì)，使用基因工程小鼠模型（GEMMs）在體內(nèi)研究腫瘤免疫肽組，試圖揭示體內(nèi)腫瘤抗原呈遞的特征。

他們構(gòu)建了一種可以在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)純化細(xì)胞特異性pMHC（peptide-MHC）的模式小鼠。通過(guò)這一工具，他們發(fā)現(xiàn)在腫瘤進(jìn)化過(guò)程中，癌癥免疫肽組的細(xì)胞特性喪失，且癌癥特異性抗原的呈遞并非由該抗原RNA的豐度或翻譯效率所驅(qū)動(dòng)。

此外，他們還鑒定了在肺腺癌（LUAD）細(xì)胞上呈遞的免疫原性表位，證明了癌癥中可靶向抗原的范圍可能比目前所知的更為廣泛。這一研究成果發(fā)表在《自然》雜志上[5]。

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為了構(gòu)建上文提到的模式小鼠，Jacks團(tuán)隊(duì)構(gòu)造了一個(gè)Cre重組酶誘導(dǎo)的、編碼高度特異性親和力標(biāo)簽StrepTagII（該標(biāo)簽將用于MHC-I復(fù)合物的親和力純化）的外顯子，該外顯子位于H2-K1的1號(hào)內(nèi)含子中（K^bStrep）。

隨后，他們將K^bStrep等位基因敲入攜帶Kras^LSL-G12D/+Trp53^fl/fl（KP）基因型小鼠的胚胎干細(xì)胞中。如此一來(lái)，在Cre重組酶腺病毒誘導(dǎo)StrepTagII表達(dá)后，就能從模式小鼠體內(nèi)純化腫瘤特異性MHC-I復(fù)合物（圖2a-b)。

圖2 KP/K^bStrep小鼠模型的設(shè)計(jì)

為了檢驗(yàn)這一模型的有效性，Jacks團(tuán)隊(duì)將KP/K^bStrep模型應(yīng)用于原位LUAD（圖3c），證明確實(shí)可以進(jìn)行特異性較高、覆蓋度較深的免疫肽組分析。

基于抗體的免疫沉淀法分離，他們得到了來(lái)自健康肺或16周荷瘤肺的H2-K^b肽；基于腫瘤細(xì)胞特異性親和力純化，他們則得到了來(lái)自16周KP/K^bStrep類型（有親和力標(biāo)簽）腫瘤以及KP/K^bWT類型（無(wú)親和力標(biāo)簽）腫瘤的肽（圖3d）。

其中，除了KP/K^bWT腫瘤樣本，其他樣本中獲得的肽段均具有一定的長(zhǎng)度分布、預(yù)測(cè)的親和力和反映K^b結(jié)合的氨基酸基序，且來(lái)自KP/K^bStrep腫瘤樣本的肽段具有更高的特異性（圖3e-h）。

圖3 KP/K^bStrep小鼠模型的驗(yàn)證

為了更進(jìn)一步探索通過(guò)親和純化分離得到的免疫肽組是否具有較高的細(xì)胞特異性，研究者們結(jié)合小鼠健康肺的scRNA-seq數(shù)據(jù)（用于將免疫肽組信息定位至相應(yīng)細(xì)胞表型），比較了來(lái)自健康肺（Normal）、荷瘤肺（Ab）或表達(dá)Strep的癌細(xì)胞（Strep）中的肽（圖4a）。

他們發(fā)現(xiàn)，Strep中肺泡2型（AT2）細(xì)胞表型顯著富集（圖4b），說(shuō)明腫瘤特異性免疫肽主要來(lái)源于AT2細(xì)胞，該結(jié)果可解釋為由AT2細(xì)胞特異性SPC啟動(dòng)子表達(dá)的Cre重組酶驅(qū)動(dòng)了腫瘤起始（圖3d）。

此外，他們還借助雜交手段獲得了Sftpc^creERT2H2-K1^Strep/Strep小鼠模型，該模型可通過(guò)三苯氧胺誘導(dǎo)StrepTagII特異性摻入健康肺組織中的AT2細(xì)胞（圖4c）。以此模型作為對(duì)照，他們?cè)u(píng)估了處于8周（早期）、12周（中期）和16周（晚期）腫瘤進(jìn)展時(shí)期的LUAD免疫肽組，發(fā)現(xiàn)腫瘤的免疫肽組特征隨著腫瘤進(jìn)展逐漸偏離正常組織，且富集腫瘤免疫肽組的細(xì)胞表型，從AT2細(xì)胞轉(zhuǎn)向了club/BASC細(xì)胞和基底細(xì)胞（圖4d-f）。

于是，根據(jù)免疫肽組的時(shí)序變化，Jacks團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步分析了腫瘤進(jìn)展對(duì)免疫肽組的影響及其相關(guān)的生物學(xué)特征。在KP模型中，他們觀察到了多肽特征的動(dòng)態(tài)變化，且腫瘤晚期特征與胃上皮模塊、高度混合轉(zhuǎn)錄基因模塊的相關(guān)性增加（圖4g-h）。

GSEA分析表明，晚期腫瘤多肽特征與炎癥細(xì)胞因子信號(hào)通路正相關(guān)，與Myc信號(hào)通路、代謝過(guò)程和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）負(fù)相關(guān)（圖4i）。此外，他們還關(guān)注了KP腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移簇特征，說(shuō)明了MHC-I呈遞存在顯著的腫瘤內(nèi)和腫瘤間異質(zhì)性（圖4j-k）。

圖4 LUAD免疫肽組在整個(gè)腫瘤進(jìn)化過(guò)程中是動(dòng)態(tài)的和異質(zhì)的

前面的探索雖然闡明了來(lái)自KP腫瘤的廣泛免疫肽組特征，但并未說(shuō)明與健康的肺或正常AT2細(xì)胞相比，KP腫瘤中特異的肽的特征（圖5a）。因此，為了了解轉(zhuǎn)錄過(guò)程和LUAD特異性肽呈遞之間的關(guān)系，他們將LUAD進(jìn)展過(guò)程中編碼LUAD特異性肽的基因的相對(duì)mRNA表達(dá)水平，與正常AT2細(xì)胞中的進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)LUAD特異性肽的呈遞效率與平均mRNA表達(dá)水平或預(yù)測(cè)的肽親和力均無(wú)關(guān)（圖5b）。

這也就意味著，mRNA表達(dá)的變化不能完全解釋單個(gè)肽的LUAD特異性呈遞效率。Jacks團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)腫瘤進(jìn)展任何階段都上調(diào)的基因進(jìn)行鑒定，及對(duì)其相應(yīng)多肽的親和力進(jìn)行預(yù)測(cè)，最終只有39個(gè)為L(zhǎng)UAD特異性肽，這也證明了以往使用RNA表達(dá)水平或親和力預(yù)測(cè)等方法篩選腫瘤特異性抗原肽的局限性（圖5c）。

相應(yīng)地，Jacks團(tuán)隊(duì)還評(píng)估了腫瘤細(xì)胞或正常細(xì)胞中的蛋白質(zhì)合成是否可以更好地預(yù)測(cè)LUAD特異性肽的呈遞。他們獲得了正常AT2細(xì)胞和KP LUAD細(xì)胞的類器官培養(yǎng)物，并在體外進(jìn)行了核糖體分析（Ribo-seq）和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）。分析結(jié)果表明，與這兩種類器官各自特征相關(guān)的基因均表現(xiàn)出更高的翻譯率（圖5d-e）。

綜合分析Ribo-seq、RNA-seq數(shù)據(jù)后，Jacks團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，有些基因在兩種類器官之間有明顯的mRNA或RPF（Ribosome Protected Fragment）豐度差異，但編碼LUAD特異性肽的基因卻通常沒(méi)有差異，且通過(guò)TE（Translation Efficiency）預(yù)測(cè)所得的肽與LUAD特異性肽的重復(fù)率非常低（圖5f-g），這也就是說(shuō)，通過(guò)蛋白質(zhì)合成也不能很好地預(yù)測(cè)腫瘤特異性抗原肽。

圖5 LUAD特異性多肽的轉(zhuǎn)錄和翻譯

最后，Jacks團(tuán)隊(duì)在KP/K^bStrep模型中發(fā)現(xiàn)了135個(gè)推測(cè)的非突變腫瘤特異性抗原（TSAs）和147個(gè)推測(cè)的腫瘤相關(guān)抗原（TAAs）（圖6a）。

為了驗(yàn)證這兩類抗原的免疫原性，他們用一種混合肽樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）疫苗（3種TSAs，5種TAAs）接種小鼠，并使用ELISpot技術(shù)檢測(cè)IFN-γ的分泌（代表著T細(xì)胞的應(yīng)答水平，側(cè)面反映抗原的免疫原性）；最終他們發(fā)現(xiàn)了三種免疫原性肽，其中兩種是無(wú)法在體外篩選到的，且難以通過(guò)RNA或RPF的表達(dá)進(jìn)行預(yù)測(cè)（圖6b-d）。

進(jìn)一步，他們利用tetramer技術(shù)對(duì)接種了5周疫苗的KP荷瘤小鼠的CD8⁺T細(xì)胞反應(yīng)性進(jìn)行評(píng)估（圖6e-f），證明了被激活的T細(xì)胞確實(shí)能識(shí)別特定序列的腫瘤抗原肽。對(duì)其余五個(gè)缺乏免疫原性的多肽，他們也進(jìn)行了分析，這些多肽在健康小鼠中被發(fā)現(xiàn)主要集中于AT2細(xì)胞，而在廣泛的肺組織中則表達(dá)很低，從而導(dǎo)致了錯(cuò)誤的推測(cè)（圖6g）。

以上分析也表明，與體外或芯片篩選方法相比，體內(nèi)的細(xì)胞特異性免疫肽組學(xué)提供了通過(guò)經(jīng)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞特異性和組織特異性呈遞模式的機(jī)會(huì)，并能更準(zhǔn)確地分類潛在抗原（圖6h）。

圖6 在LUAD中發(fā)現(xiàn)新的腫瘤抗原

總的來(lái)說(shuō)，Jacks團(tuán)隊(duì)的這項(xiàng)研究不僅揭示了體內(nèi)腫瘤免疫肽組能促進(jìn)對(duì)環(huán)境特異性抗原呈遞的進(jìn)一步研究，提高我們對(duì)腫瘤-免疫相互作用的理解；還提供了一個(gè)通用的小鼠模型，協(xié)助研究者更廣泛地探索在健康和疾病中具有高分辨率的抗原呈遞機(jī)制。

期待這個(gè)研究能給我們帶來(lái)更準(zhǔn)確的癌癥抗原表位和更好的癌癥免疫療法。

參考文獻(xiàn)

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