小靈子，我，即將畢業(yè)的醫(yī)學研三狗，分享一下從師姐以及大神那里學來的提質粒方法，第一次做，算比較成功，雖然其中過程非常曲折。中間問了身邊好多同學，都不是很會，研一上課的時候學實驗，老師也只是簡單講了一下提純的步驟，所以我這個科研小白還是打算來和大家分享一下，希望對有需要的同學有所幫助，也希望大家能夠多多交流，萬一有大神指點呢！

Day1

第一天最重要的是什么！當然是準備工作！

準備工作

1. 配液體 LB（這個東西我們這么叫，但是同科室專門做菌的小姐姐管它叫腦心脊液，也是我比較困惑的一點）蛋白胨 10g， 酵母 7.5g， NaCl15g，去離子水定容到 1000ml —— actually，用不了那么多，兩個樣最多用 300ml，剩下的近期沒有其他人用，扔掉我們還很心痛，所以暫時還放在我們 4℃ 冰箱里保存著嗚嗚嗚——所以，如果沒有那么多樣品的話，建議可以按比例減掉的喲！

2. 配 CaCl 2 ：4.44g CaCl 2 + 500ml 去離子水 （當然一次就用一點點，也可以按比例遞減的）不過沒用完，沒結晶的話以后也可以用。

3. 配固體培養(yǎng)基：蛋白胨 1g ， 酵母 0.5g， NaCl 1g ， 瓊脂1g，去離子水定容到 100ml。

4. 玻璃珠（這個是涂我們的小菌菌用的，我覺得用接種環(huán)、干凈的棉簽、小木棍都可以，實驗室有啥用啥，能省就?。。?/span>

5. 一套槍頭（作為科研狗就別問我一套槍頭是什么意思了?。?/span>

6. 玻璃培養(yǎng)皿 (講道理，塑料的10cm皿也可以)。

7. 離心管（ 15ml 的多來點?。?/span>

8. 一盒Ep管（ 1.5ml 的就夠了）

9. 配抗生素：

Ampicillin ：工作液 100μg/ml ,可以先配成 100μg/μl ,用時 1:1000

Kanamycin ：工作液 25μg/ml ,可以先配成 25μg/μl ,用時 1:1000（不一定每個質粒都一樣哦，記得看它帶來的說明書?。。。?/span>

PS：固體培養(yǎng)基先不要高壓，涼了就凝了！其他的速度高壓，烘干放在超凈臺里等待我們接下來的實驗hiahia~

步驟一：搖菌

將大腸桿菌（一點就夠~具體我反正是加了 10μl ）3~4ml LB 培養(yǎng)基中， 37℃ 過夜，劇烈搖晃~ 150-200r 就可以啦。SHAKE! JUST SHAKE! LET’S SHAKE!（我用的是大腸桿菌，其他菌種，作為一個菜鳥我也不是很清楚了！如果實在不知道就去多問一問吧、自己查去！哈哈哈哈哈）

Day2:又是新的一天！

步驟一：菌種活化

把我們昨天搖的菌拿出來，觀察一下下它活沒活——如果活了它會又臭又渾濁的~但是會很開心~小菌菌它活了~

菌：LB=1:1000 （大神表示其實 1:100~1:300 比較好，能活化的快一點） 37℃，110r 劇烈搖， 1~1.5 小時 （可能 3h更好一些）

目的：讓菌液的 OD 值在 0.3~0.6 之間，處于對數(shù)期。

步驟二：高壓滅菌

高壓滅菌，請根據(jù)自己實驗室的情況在活化菌種的三個小時里，高壓固體培養(yǎng)基。

高壓完的固體 LB 冷卻到手溫—這個溫度需要自己掌握，我第一次做的時候就翻車了，因為冷卻到手溫再加抗生素再倒就已經來不及了，前幾個皿還算可以，剩下的直接給我凝在了錐形瓶里，所以第二次老師弟幫我問了度娘，說手心不燙手背燙的溫度就可以了（當然這個有點迷幻我沒做到）

后來我又問了實驗室養(yǎng)菌的美麗小姐姐，她表示 50~60℃ 就可以，她加很多種抗生素，那些抗生素該好用還是會好用的，于是我做的時候就放心大膽地只要 溫度降到在我手可以忍受的程度了，就開始加抗生素然后倒平皿！

所以真正的實驗步驟開始了：以下步驟請在超凈臺中完成。

高壓后的固體培養(yǎng)基冷卻到實驗者自己可以忍受的溫度，按質粒說明書上所帶的抗生素濃度加入抗生素，倒入平皿中，打開排風扇，打開平皿蓋等凝固，凝固后蓋上平皿蓋，倒置平皿。

PS：磨嘰的我又來了！倒平皿的時候請把皿拿起來半蓋蓋子胳膊肘放在臺子上，皿舉在你的眼睛前面，這樣能保證你的手不會污染皿，也能保證你能看到倒了多少培養(yǎng)基進去。像這樣：

培養(yǎng)基的量就是不能太薄到一挑就破了，也不能太多，要不其他皿該不夠了。

然后培養(yǎng)基倒完了不能有氣泡，要平整—老師弟在我耳邊這樣念叨。

步驟三

取出搖好活化的菌，取 1~1.5ml 加入 Ep 管中， 4℃ ， 1000r ， 1min（這個我覺得取決于你要提幾個質粒，樣品多的話取兩管 1.5ml 的）。

步驟四

用槍頭吸出培養(yǎng)基，加入 200μl 預冷過的 4℃ CaCl2 ， 吹打混勻，分裝 5 0μl 一管，制備感受態(tài)。

步驟五

把分裝出的 EP 管在冰上靜置 20min ，加入質粒 50~100ng （我覺得如果質粒濃度本身就高可以多加一點，畢竟少于1μl量太小不好掌握，別浪費就行），再冰上靜置 20min ， 熱激42℃，90s （務必精準迅速！），插回冰上，靜置 10min 。

熱激是為了打開孔道，讓質粒進入，插回冰上是為了關閉孔道，讓質粒出不來~hiahia~（這一步是很重要的一步，隱藏著很多細節(jié)，比如你什么時候制冰，什么時候開恒溫水浴箱，原始的質粒什么時候找出來，我就提醒到這里啦，根據(jù)自己實驗室情況看著辦吧）。

步驟六

加入無抗生素 LB 每管 500μl ， 37℃ 慢搖（ 80r ）， ????????????????????????????????1h。

目的：轉進去質粒的細菌表達出抗性蛋白，使細菌耐對應的抗生素。

步驟七

涂板，這時候就是要用到玻璃珠或者接種環(huán)balabala的，加入適量菌液（我怕菌不算太多，加了 80μl ，一般 50μl 就夠，太多了菌落容易瘋長不好挑菌），玻璃珠就輕輕來回搖就可以了，你能看到培養(yǎng)基上菌液劃過的痕跡。接種環(huán)或者別的就自己想吧，反正涂開就行。

Like this ~

步驟八

倒置平板， 37℃ 孵箱過夜。

PS：今天的實驗要設置好對照，需要有加抗生素培養(yǎng)基的空白對照，加了菌種的陰性對照，和你的樣品。如果明天一看空白對照和陰性對照長了菌，恭喜你不用繼續(xù)往下做了，要不就是污染了，要不就是抗生素不好使。如果明天你的樣品沒長出來菌，恭喜你也做不下去了，要不就是抗生素加多了，要不就是質粒沒進去哈哈哈哈！(以上代表個人觀點，如有不對請告訴我！)

Day3:又是新的一天！

步驟一

取出平皿，觀察菌落是否生長， 4℃ 倒置放（先保存一會， 37℃ 時間久了菌落會太多）

步驟二

將抗生素按說明書濃度加入 LB 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基 3~4ml ，挑出菌落，連槍頭一起打入（注意是單個菌落，我問了一個可愛的老師什么叫單個菌落，我們一致認為就是長得小的哈哈哈）

為了以防萬一，第一次做這個實驗的我選擇挑了兩個看著順眼的小菌落~

步驟三

37℃ ，劇烈搖 150r 過夜。

PS：挑菌的時候用槍頭，盡量不要扎破培養(yǎng)基，并且挑一半留一半，我覺得輕輕刮下來就好，畢竟只是為了把小菌菌挑出來繼續(xù)長。這步時間很少，找空隙做就好，晚上離開實驗室之前給它搖上就行，因為菌搖的時間不宜太長， 15~17h 比較好，太久的話菌會老化也會變得太多。

前面忘記說了，因為大腸桿菌的特性，這種離心管搖的時候要擰松但是拔不下來。然后搖的時候離心管斜著插，保證能搖起來。

大概圖中介個亞子：

Day4：又又又是新的一天！

今天我們就要用到 21 世紀科研工作者的福音：試劑盒，今天需要先小提一下先驗證一下擴增的質粒是否和原質粒一致，第二天再進行質粒大提。

質粒小提不要把菌液都用了，否則大提就沒有菌啦！4ml我就用 1.5ml ，一個 EP 管的量就可以啦。

步驟一： 質粒小提

質粒小提：下面附上說明書（我和老師弟一致認為這玩意太好用了）。

PS:小提的時候就不用在超凈臺里面啦!只要按照說明書操作就可以啦，注意試劑順序不要加反什么的。離心時間和加入液體的體積按自己菌液的情況加入，我，身為一個天秤，在保證實驗能進行下去的情況下都取了比較中間的值~

質粒小提的這個試劑盒不是去內毒素的，價格很便宜，畢竟只是為了初步驗證質粒質量，如何驗證呢？蛋白用 WB ，核酸當然用瓊脂糖 ~

步驟二： 瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳：自己好好查一下配 LB 培養(yǎng)基的瓊脂和瓊脂糖！試劑上多數(shù)都是英語，用翻譯軟件的時候一定要看清楚不要弄反了，瓊脂糖好貴的呢！

a)制備瓊脂糖凝膠：

• 選擇足夠點樣口數(shù)量的塑料膠槽。 （點樣孔數(shù)量=你的樣品數(shù)量× 2+marker ，因為要對比一下提出來的樣品和原樣品是否是一樣的東西）
• 配制 1×TAE／TBE電泳緩沖液放于三角燒瓶中， 1g瓊脂糖粉+ 50ml 1×TAE／TBE （ 1%~2% 均可，我就 50ml 大概稱了 0.7g ，濃度在 1%~2% 中間）
• 微波爐大概冒泡泡三次就可以?？刂苹鸷颍苊庖绯?。
• 冷卻至 60℃ 左右后，按你自己買的 E B 終結者的說明書加進去 （什么 GEL GREEN/GEL RED/SYBR GREEN 的太多樣了）
• 迅速插上合適大小的梳子，以形成點樣孔。 （我覺得倒膠之前放進去也可以）
• 待凝膠完全凝固后 （約半小時以上） ，小心拔出梳子。
• 將凝膠安放到電泳槽內。

b)點樣：上樣前預電泳3~5 min 。核酸樣品與上樣緩沖液混合后，點樣，先加入 Marker 。6×loading的話就可以：1μlloading ， 3μl去離子水， 2μl核酸樣品（感覺這個實驗整個就很隨意，根據(jù)自己條件調節(jié)吧）。

c)電泳：加樣后的凝膠板立即通電進行電泳，電壓 60-100V，樣品由負極（黑色）向正極（紅色）方向移動。電壓升高，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低，當溴酚藍移動到距離膠板下沿約 1cm處時，停止電泳。

d)電泳后的凝膠照相：將染色后的凝膠置于紫外燈下進行照相。攝影用的紫外模式。選擇合適曝光時間，一般為5 秒左右。

大致分子量位置相同則你的質粒就是成功的啦，拿 Day3 所得菌液剩下的繼續(xù)搖菌，等著明天大提就可以啦~

這里要說一下我又問的傻乎乎的問題，大提我就是用小提 剩下的菌+100ml 加抗生素 LB ， 150r 劇烈搖，過夜 。為了空間夠我用的是錐形瓶，然后把蓋子弄松以后打開機器開始 shake，蓋子，居然，飛了出去！還好我眼疾手快扶住了！急忙問了大神，大神表示，你們那個錐形瓶蓋子是透氣的吧。

我……感覺自己是個 simpleton！神奇的透氣蓋子如圖

Day5：質粒大提

• 說明書懶得找了，你也可以用別的牌子的哈哈哈哈，估計都很好用。
• 大提也不用在超凈臺里面。
• 大提以后也是要電泳看一下質量的。
• 等電泳的時間，可以測濃度& OD 值，調空白的時候看你大提最后用的什么洗脫液，用什么洗脫就用什么調零。濃度肯定就看菌的多少啦， O D 值在 1 .8~2 之間一般就可以啦，我看網上說啥的都有，大概就是這個范圍了，多于少于都代表有 R NA 或者其他什么的污染，自己問度娘吧。
• 最后：確定質粒質量和濃度→稀釋成方便使用的濃度→得到一堆質?！鸀V器過濾→完成啦！

以上就是我做質粒擴增及提純的全部經驗啦，啰啰嗦嗦說了一大堆，在這里感謝，在這一個簡單實驗期間為我提供各種支持的老師們和小伙伴們~