四、生物信息分析流程性能確認(rèn)指標(biāo)

本方案中，在參考計(jì)算機(jī)軟件評估要求的基礎(chǔ)上擬定mNGS生物信息分析流程性能確認(rèn)的評估指標(biāo)，主要包括準(zhǔn)確率、召回率、精確率、F1-Score和最低測序數(shù)據(jù)量^［37］。

（一）準(zhǔn)確率、召回率、精確率和F1-Score

1.生物信息分析陽性檢出閾值的標(biāo)準(zhǔn)：（1）檢出種特異性序列數(shù)至少1條；（2）與同屬內(nèi)檢出序列數(shù)第一位物種間比值大于10%^［7］。

2. 肺泡微生態(tài)模擬數(shù)據(jù)的生成：對1 000份既往已進(jìn)行mNGS檢測的BALF標(biāo)本進(jìn)行重分析，統(tǒng)計(jì)標(biāo)本中微生態(tài)的組成和豐度情況，使用宏基因組仿真數(shù)據(jù)生成軟件（Critical Assessment of Metagenome Interpretation，CAMISIM）模擬微生態(tài)數(shù)據(jù)^［35］。

3. 模擬陽性標(biāo)本測序數(shù)據(jù)的生成：隨機(jī)生成10、100、1 000、10 000和100 000條病原體序列，并分別與微生態(tài)模擬數(shù)據(jù)整合。使用自建分析流程和數(shù)據(jù)庫對每份模擬數(shù)據(jù)重復(fù)分析100次，分別計(jì)算：準(zhǔn)確率=（TP+TN）/（TP+FN+FP+TN）；召回率=TP/（TP+FN）；精確率=TP/（TP+FP）；F1-Score=2×準(zhǔn)確率×召回率/（準(zhǔn)確率+召回率）；TP，真陽性；FP，假陽性；TN，真陰性；FN，假陰性。

（二）最低測序數(shù)據(jù)量

對上述1 000份BALF的背景微生物進(jìn)行基因組大小的加權(quán)平均計(jì)算，獲得背景微生物的平均基因組長度。根據(jù)人源序列和背景微生物的比例分布范圍，估算背景微生物平均拷貝數(shù)。

已有數(shù)據(jù)表明，BALF宿主細(xì)胞中位值在10⁵ 細(xì)胞數(shù)/ml，極限高值為10⁷ 細(xì)胞數(shù)/ml^［38］。本方案中，擬定病原體最低拷貝數(shù)10³ 拷貝/ml，并考慮背景菌平均基因組和拷貝數(shù)。

根據(jù)Dirk H?per團(tuán)隊(duì)提供的數(shù)學(xué)模型（伯努利隨機(jī)過程）推導(dǎo)出所需最低測序數(shù)據(jù)量^［39］。

五、mNGS實(shí)驗(yàn)流程建立

mNGS濕實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)的方法學(xué)建立主要涉及核酸提取、建庫等流程，在檢測體系建立時(shí)，需進(jìn)行充分評估。第一，不同的提取試劑對細(xì)菌、真菌、病毒的核酸提取效率存在差異^{［40, 41, 42］}。同時(shí)，提取流程中是否有破壁過程以及破壁的條件也會影響核酸提取效率^［12］。第二，根據(jù)已發(fā)表的專家共識，當(dāng)臨床標(biāo)本中宿主細(xì)胞濃度高時(shí)，為提高低載量病原體的檢出率，建議添加去宿主過程^［42］。第三，mNGS應(yīng)用于科學(xué)研究時(shí)多采用單份標(biāo)本最低20M的測序數(shù)據(jù)量，但臨床應(yīng)用時(shí)需要多少測序數(shù)據(jù)量存在較大的爭議。建議在建立方法學(xué)時(shí)，進(jìn)行最低測序數(shù)據(jù)量的評估。第四，背景微生物的核酸片段是干擾mNGS結(jié)果的重要因素。建議在建立方法學(xué)時(shí)，根據(jù)實(shí)際情況建立背景核酸數(shù)據(jù)模型^{［1，5，16］}，協(xié)和方案如下。

（一）核酸提取效率評估

使用固定CFU的代表性菌株，使用Qiagen的提取試劑盒提取核酸，并使用微滴式數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）進(jìn)行定量，每一菌株重復(fù)3次以計(jì)算均值；以陰性BALF剩余標(biāo)本為基質(zhì)，加入固定CFU的代表性菌株制備模擬標(biāo)本，以實(shí)驗(yàn)室擬使用的提取流程進(jìn)行核酸提取，使用ddPCR進(jìn)行定量，并重復(fù)3次以計(jì)算均值；計(jì)算兩者間比值，定義為提取流程對代表性菌株的提取效率。

（二）去宿主病原體損耗評估

去宿主病原體損耗評估參考盤制備：擬投入的病原體為鮑曼不動桿菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、肺炎鏈球菌、白色念珠菌、煙曲霉、表皮葡萄球菌、巨細(xì)胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）、EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）和腺病毒，每種病原體濃度擬設(shè)定為1 000 拷貝/ml，每份標(biāo)本中宿主細(xì)胞濃度擬控制在10⁵ 細(xì)胞數(shù)/ml。

隨機(jī)選擇6份模擬標(biāo)本平均分為2組，一組使用去宿主試劑進(jìn)行處理，另一組不進(jìn)行去宿主處理，獲得核酸后同時(shí)進(jìn)行建庫測序和ddPCR。

統(tǒng)計(jì)分析2組不同處理標(biāo)本目標(biāo)病原體每百萬序列數(shù)（reads per million，RPM）和定量結(jié)果的差異。

統(tǒng)計(jì)分析2組標(biāo)本宿主基因組比率和內(nèi)參基因定量結(jié)果的差異。

（三）最低測序數(shù)據(jù)量評估

1.DNA流程最低測序數(shù)據(jù)量參考盤制備：擬投入病原體同“五（二）”中使用的病原體。分別使用宿主細(xì)胞濃度為10⁵ 細(xì)胞數(shù)/ml和10⁷ 細(xì)胞數(shù)/ml的肺泡灌洗液剩余標(biāo)本作為稀釋基質(zhì)^［38］，建議每種病原體濃度1 000 拷貝/ml，不同宿主濃度梯度的標(biāo)本建議重復(fù)檢測不少于5次^［5］。

2.RNA流程最低測序數(shù)據(jù)量參考盤制備：擬投入病原體甲型流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒和冠狀病毒，每種病原體濃度為1 000 拷貝/ml（參考ddPCR結(jié)果）。宿主細(xì)胞濃度同DNA流程最低測序數(shù)據(jù)量參考盤。不同宿主濃度梯度的模擬標(biāo)本建議重復(fù)檢測不少于5次^［5］。

3.最低測序數(shù)據(jù)量評估：每份標(biāo)本的測序數(shù)據(jù)量為400 兆（megabyte，M）reads，隨機(jī)抽取12.5、25、50和100 M各20次分別進(jìn)行生信分析流程進(jìn)行分析，通過probit回歸分析合理的最低測序數(shù)據(jù)量。

（四）建立試劑及環(huán)境背景核酸數(shù)據(jù)庫

1.試劑工程菌背景核酸的建立：（1）酒精清潔雙手，建議準(zhǔn)備好2 ml EP管12個(gè)，在試劑準(zhǔn)備間超凈工作臺內(nèi)，每個(gè)EP管中分裝1 ml生理鹽水并編號；（2）將標(biāo)本隨機(jī)平分為2組，分別使用去宿主流程和不去宿主流程進(jìn)行測序；（3）測序后，分析去宿主流程和不去宿主流程的微生物檢出情況和相對豐度。

2.實(shí)驗(yàn)室空間和設(shè)備表面背景核酸的建立：（1）酒精清潔雙手，按照實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況準(zhǔn)備2 ml EP管若干，在核酸提取區(qū)生物安全柜中分裝1 ml 生理鹽水至每個(gè)EP管中并編號。（2）使用無菌拭子分別對每個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)的臺面和設(shè)備（實(shí)驗(yàn)臺面、生物安全柜、離心機(jī)孔位及表面、均質(zhì)儀孔位及表面、PCR擴(kuò)增儀孔位及表面、渦旋震蕩儀表面、恒溫金屬浴孔位及表面、測序儀表面、操作人員手部、口罩外層等）進(jìn)行擦拭采集環(huán)境標(biāo)本，將拭子裝入EP管中進(jìn)行振蕩混勻。建議同一位置連續(xù)3 d進(jìn)行標(biāo)本采集。為便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，建議每批次實(shí)驗(yàn)設(shè)置1份未采集環(huán)境標(biāo)本的拭子作為空白對照。（3）測序后，分析各位置的微生物組成和相對豐度，建立實(shí)驗(yàn)室操作空間和設(shè)備背景核酸數(shù)據(jù)模型。

（五）質(zhì)量控制點(diǎn)和風(fēng)險(xiǎn)控制點(diǎn)設(shè)置

建議測定提取核酸的濃度和純度，DNA/RNA的A₂₆₀/A₂₈₀比值不低于1.8/2.0。文庫構(gòu)建完成時(shí)再次測定核酸濃度和純度，當(dāng)文庫濃度低于0.1 ng/μl時(shí)，建議重新實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，建議測序數(shù)據(jù)量和測序質(zhì)量值作為質(zhì)量控制點(diǎn)之一，當(dāng)測序數(shù)據(jù)量低于最低測序量或Q30低于80%時(shí)，建議重復(fù)檢測。同時(shí)，本方案建議在標(biāo)本中加入經(jīng)過ddPCR定量摩爾濃度的大腸桿菌噬菌體（DNA流程使用T7噬菌體，RNA流程使用M2噬菌體）作為內(nèi)標(biāo)；建議每輪實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測3倍最低檢出限（limit of detection，LoD）濃度的弱陽性質(zhì)控、10倍LoD濃度的陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控。

六、mNGS全流程性能確認(rèn)參考盤制備

目前，對于病原mNGS性能確認(rèn)參考盤的制備缺少統(tǒng)一和規(guī)范的標(biāo)準(zhǔn)。國外針對呼吸道標(biāo)本和腦脊液標(biāo)本的參考盤制備方法是在陰性的臨床標(biāo)本中加入梯度稀釋的臨床陽性標(biāo)本、病原體培養(yǎng)物或病原體核酸^{［5，11］}。該方法保證了參考盤接近臨床標(biāo)本的理化性質(zhì)和微生態(tài)特征，但無法固定宿主細(xì)胞率，且臨床標(biāo)本異質(zhì)性高，標(biāo)本間微生態(tài)存在差異。不同的參考盤配置方法各有利弊^{［5，11］}，本方案中建議使用宿主細(xì)胞混合病原體或臨床陽性標(biāo)本的策略。

（一）DNA流程性能確認(rèn)參考盤制備

使用mNGS檢測為陰性的肺泡灌洗液剩余標(biāo)本和生理鹽水作為稀釋基質(zhì)，建議宿主細(xì)胞濃度設(shè)定為10⁵ 細(xì)胞數(shù)/ml；分別投入“五（二）”中使用的病原體，建議病原體濃度梯度設(shè)定為0（空白）、160、800、4 000、20 000和100 000拷貝/ml。

（二）RNA流程性能確認(rèn)參考盤制備

使用mNGS檢測為陰性的肺泡灌洗液剩余標(biāo)本和生理鹽水作為稀釋基質(zhì)，按照“六（一）”濃度梯度，分別投入“五（三）2”中使用的病原體。

七、mNGS全流程性能確認(rèn)

對于mNGS檢測，標(biāo)本采集和轉(zhuǎn)運(yùn)過程、宿主細(xì)胞濃度等可影響背景核酸、陽性判斷閾值和LoD等性能。建議針對一般情況，初步建立檢測體系的陽性判斷閾值、LoD、精密度、抗干擾、交叉反應(yīng)情況，并對標(biāo)本的穩(wěn)定性和臨床實(shí)際應(yīng)用時(shí)檢測體系的準(zhǔn)確性進(jìn)行初步探討。

（一）BALF相關(guān)背景核酸、陽性判斷閾值和LoD

使用實(shí)驗(yàn)室建立的實(shí)驗(yàn)流程對制備的參考盤進(jìn)行檢測，分別統(tǒng)計(jì)不同病原體的RPM，結(jié)合試劑及環(huán)境背景核酸模型，分別繪制相應(yīng)的受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC曲線）以確立相對合理的陽性判斷閾值。

使用probit回歸計(jì)算不同病原體的LoD^［7］。

對于暫時(shí)無法或難以獲取的其他病原體，建議通過統(tǒng)計(jì)陰性BALF標(biāo)本、試劑及環(huán)境背景核酸中各病原體的RPM，以均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差作為陽性判斷閾值^［43］。

（二）精密度確認(rèn)

1.使用同批次試劑：對弱陽性標(biāo)本（3倍LoD濃度）和陽性標(biāo)本（10倍LoD濃度）分別進(jìn)行20次重復(fù)檢測并統(tǒng)計(jì)RPM，建議每天重復(fù)5次檢測，連續(xù)4 d完成評估。

2.使用不同批次試劑：對弱陽性標(biāo)本和陽性標(biāo)本分別進(jìn)行20次重復(fù)檢測并統(tǒng)計(jì)RPM，建議每天重復(fù)5次檢測，連續(xù)4 d完成評估。

（三）抗干擾確認(rèn)

調(diào)整弱陽性標(biāo)本的宿主細(xì)胞濃度至10⁵、10⁶、10⁷細(xì)胞數(shù)/ml 3個(gè)濃度梯度，分別進(jìn)行測序。以弱陽性質(zhì)控?zé)o法檢出時(shí)內(nèi)參的RPM值為抗宿主干擾閾值。當(dāng)進(jìn)行臨床報(bào)告解讀時(shí)，若內(nèi)參的RPM超出閾值，需警惕假陰性。

（四）交叉干擾確認(rèn)

選取若干種近源物種，例如金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌、白色念珠菌和熱帶念珠菌，將兩對微生物分別按照1∶1、9∶1、1∶9的濃度比例進(jìn)行混合后測序；統(tǒng)計(jì)分析近源物種的檢出情況和比例與預(yù)期是否一致。

（五）穩(wěn)定性確認(rèn)

將弱陽性標(biāo)本和陽性標(biāo)本在4 ℃和?20 ℃分別保存1、4、7 d之后進(jìn)行檢測，統(tǒng)計(jì)RPM；一般認(rèn)為標(biāo)本在?80 ℃可在較長時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定保存。本方案建議評估?80 ℃保存的標(biāo)本反復(fù)凍融時(shí)對結(jié)果的影響。分別評估在?80 ℃保存的標(biāo)本凍融1和2次后檢測結(jié)果的RPM變化情況。

（六）臨床準(zhǔn)確性評估

建議收集既往mNGS檢測結(jié)果為陰性的BALF剩余標(biāo)本50份，陽性剩余標(biāo)本20份，分別進(jìn)行DNA流程和RNA流程檢測。對于陽性標(biāo)本，建議與既往培養(yǎng)結(jié)果或使用PCR復(fù)核^［26］，統(tǒng)計(jì)總符合率、陽性符合率和陰性符合率。

八、mNGS全流程標(biāo)準(zhǔn)操作作業(yè)書（standard operating procedure，SOP）建立

完成性能確認(rèn)后，建議根據(jù)建立的實(shí)驗(yàn)流程，編寫可讀性強(qiáng)的SOP。建議分別制定DNA流程和RNA流程的SOP，涵蓋實(shí)驗(yàn)操作具體步驟及注意事項(xiàng)、質(zhì)量控制點(diǎn)及操作處理指示、實(shí)驗(yàn)記錄的規(guī)范和注意事項(xiàng)、數(shù)據(jù)分析及解讀流程、數(shù)據(jù)備份及安全管理指示和管理員權(quán)限等重要的具體細(xì)節(jié)，保證全流程的操作規(guī)范、可重復(fù)和可溯源^［11］。

近年來，mNGS技術(shù)對臨床感染性疾病的診斷，尤其是在新發(fā)突發(fā)病原體比如新型冠狀病毒的鑒定中發(fā)揮了重要作用。但目前病原mNGS的性能確認(rèn)、質(zhì)量控制和規(guī)范化的管理，學(xué)術(shù)界仍然有較大空白。為保證臨床檢測結(jié)果的可靠性，本方案中提出的性能確認(rèn)流程相對復(fù)雜。盡管性能確認(rèn)不能解決mNGS技術(shù)中存在的諸多問題，但能夠?yàn)閙NGS的工作人員提供諸如核酸提取效率、去宿主效率、數(shù)據(jù)庫、生物信息學(xué)分析流程、背景核酸和陽性判斷閾值等相關(guān)參數(shù)信息，同時(shí)能夠明確全流程的精密度、LoD、抗干擾、交叉反應(yīng)和穩(wěn)定性等相關(guān)性能，這些信息對于mNGS報(bào)告解讀具有重要的指導(dǎo)價(jià)值。本方案中仍存在不足和錯(cuò)誤之處，希望同行批評指正，繼續(xù)完善性能確認(rèn)方案，為mNGS的臨床規(guī)范化應(yīng)用貢獻(xiàn)更多的智慧和力量。