作者：檢驗視界

作者： 李貽林 楊學(xué)習(xí) 謝冰怡 胡冬梅

基金項目：廣州市重點(diǎn)研發(fā)計劃項目（ 202103000026 ）

作者單位：1.廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司，廣東，廣州 510515

2. 南方醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，廣東，廣州 510515

3. 南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院產(chǎn)科，廣東，廣州 510515

通訊作者：胡冬梅

[摘 要]

近年來發(fā)展起來的宏基因組測序技術(shù)，對孕產(chǎn)婦的病原體不明感染性疾病的診斷尤為適用。本文對該技術(shù)在妊娠期感染性疾病中的應(yīng)用，以及關(guān)鍵環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制進(jìn)行了歸納總結(jié)。

女性懷孕后，更為容易感染各種病原體。而且，感染的早期臨床癥狀和體征易被掩蓋，這使得孕產(chǎn)婦感染性疾病的病情進(jìn)展更快速，更容易發(fā)展成更為嚴(yán)重的膿毒癥、膿毒性休克、多器官功能衰竭，甚至死亡。除外，妊娠合并感染性疾病還將對胎兒產(chǎn)生不良的影響，是導(dǎo)致胎兒畸形、流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎膜早破、死胎、胎兒生長受限等的重要原因。

宮內(nèi)感染是產(chǎn)科臨床上最常見感染類型，許多宮內(nèi)感染沒有任何癥狀，診斷通常比較困難，往往存在漏診、且被漏治的宮內(nèi)感染對孕母及其后代將會產(chǎn)生何種近期或遠(yuǎn)期的影響尚未可知。

臨床上炎癥指標(biāo)，例如白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量、降鈣素原、白細(xì)胞介素-6、C-反應(yīng)蛋白質(zhì)雖然對于區(qū)分感染和非感染有一定幫助，但正常孕婦也會反映出一定程度的升高。

對于感染性疾病診治的關(guān)鍵在于查找病原體。目前，臨床上用于病原體檢測的主要方法為培養(yǎng)的方法、血清學(xué)方法、病理檢查以及分子生物學(xué)方法等。然而，這些方法或多或少地存在出結(jié)果時間過長、敏感性不夠，假陰性率高、無法直接檢出病原體、只能對已知的病原體進(jìn)行逐個排查，而不能檢測未知病原體等弊端。

宏基因組新一代測序技術(shù)(metagenomics nextgeneration sequencing, mNGS) 直接提取臨床樣本中的核酸進(jìn)行高通量測序，通過生物信息學(xué)算法，分析樣本中包含的病原微生物種類，運(yùn)用數(shù)據(jù)比對軟件，可以快速從臨床送檢樣品中準(zhǔn)確檢出病原微生物 [8] 。宏基因組能夠無偏倚地在同一樣本中同時檢測已知或者未知的所有病原微生物，也就是能同時檢測細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲、支原體、衣原體等。此外，病原檢測的敏感性更高，出報告時間更短，還可以直接分析出樣本中的病原體譜、豐度和分布情況，了解潛在病原體的變化情況等，更適用于傳統(tǒng)檢測結(jié)果陰性的感染患者，以及免疫缺陷患者和危重癥感染患者的病原體檢測 [7] 。

本文通過對mNGS檢測優(yōu)勢、實驗流程及報告解讀規(guī)則進(jìn)行綜述，探討了mNGS在妊娠期感染性疾病中的臨床應(yīng)用價值，從而為mNGS在產(chǎn)科臨床的應(yīng)用提供了更多的理論依據(jù)。

實驗流程

1.1 樣本采集

1.1.1 靜脈血標(biāo)本采集

成人的采血量為4mL。采集的血液推薦存放于有游離 DNA 保護(hù)功能的無創(chuàng)專用采血管。

1.1.2 羊水標(biāo)本采集

如懷疑宮內(nèi)感染，可采集羊水標(biāo)本。對于懷疑胎兒感染者，可進(jìn)行臍靜脈穿刺。

1.2 核酸提取

為了提高mNGS的檢測靈敏度，可以結(jié)合臨床檢測需求，進(jìn)行人源核酸的去除。

為提高胞內(nèi)菌、真菌等的檢出率，提取前應(yīng)對樣本進(jìn)行破壁處理。

1.3 文庫構(gòu)建及上機(jī)測序

1.4 生物信息學(xué)分析

生信分析方法主要體現(xiàn)在比對方法優(yōu)化以及下游分析。為了縮短分析時間，提高分析準(zhǔn)確性，需要在速度和精度做重點(diǎn)優(yōu)化，除此之外，在計算資源、能耗、體系結(jié)構(gòu)等方面也存在著優(yōu)化空間。

1.5 出具報告

報告出具過程中應(yīng)參考疑似背景微生物庫及陰性對照檢測結(jié)果，尤其是呼吸道定植菌，并結(jié)合所提供的臨床信息，最終給出檢測報告。檢測報告應(yīng)包括檢出序列數(shù)、平均測序深度、基因/基因組覆蓋度和相對豐度等內(nèi)容。

圖3 mNGS實驗流程和分析流程

1.6 mNGS 報告解讀規(guī)則

mNGS可同時檢測出樣本中的多種微生物，例如細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲、支原體、衣原體、螺旋體等，但mNGS的陽性閾值受到多種因素的影響，如測序平臺、測序流程、測序數(shù)據(jù)量、樣本類型、病原種類、患者病情等。測序平臺在三代測序測序片段更長，但是存在一定的測序錯誤率，造成假陽性，同時二代測序由于測序片段過短，存在親緣關(guān)系比較近的微生物無法區(qū)分，造成假陰性，故結(jié)合測序平臺質(zhì)控品檢測結(jié)果進(jìn)行判定更符合臨床真實結(jié)果。

討論

孕婦罹患感染性疾病的病原體有多種，感染性疾病病原體及其藥敏的快速鑒定，有助于幫助臨床盡快啟用敏感的抗生素，迅速緩解癥狀、改善母兒預(yù)后，具有重要的意義[16]。

然而，滯后的細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果，使得初始治療一般只能經(jīng)驗性地采用廣譜抗生素。這卻可能導(dǎo)致耐藥基因傳播、加劇多重耐藥和繼發(fā)真菌感染。而與培養(yǎng)法相比，分子診斷在病原學(xué)檢測方面有進(jìn)一步16S rRNA基因可作為菌種鑒定的分子標(biāo)記；而基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）能快速準(zhǔn)確鑒定細(xì)菌、真菌等微生物。

針對mNGS技術(shù)應(yīng)用于妊娠期感染性疾病，發(fā)現(xiàn)采樣對于結(jié)果影響由于重要，故針對不同的妊娠情況采集不同的樣本類型；在報告解讀中需要臨床醫(yī)生的參與，盡量將mNGS檢測到的微生物結(jié)合患者的臨床癥狀及其他檢測技術(shù)的檢測結(jié)果綜合考慮，多學(xué)科的綜合考慮，能更好的給臨床醫(yī)生提供證據(jù)進(jìn)行診療方案的制定。

值得注意的是，雖然mNGS在產(chǎn)科中的作用巨大，但是這種方法還存在檢測費(fèi)用高、醫(yī)院難以配備這種設(shè)備、送檢較麻煩、以及過度敏感可能導(dǎo)致的假陽性結(jié)果。低豐度微生物的檢測在臨床中的意義不詳、病原體檢查結(jié)果需要與臨床癥狀、體征以及輔助檢查結(jié)果結(jié)合起來進(jìn)行綜合判定等。

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排版 | 張寧

審校 | 方研