在面對外界形形色色的病原時，我們體內(nèi)種類繁多的天然功能抗體組成了一道強有力的免疫防線保衛(wèi)了我們的健康。時至今日，隨著免疫學和分子生物學技術(shù)的發(fā)展，研究人員已經(jīng)可以在體外分離、純化制備抗體，并直接促使了抗體藥物的誕生。

抗體藥物

自從1986年第一個治療性抗體莫羅單抗-CD3（Muromonab-CD3）進入臨床應用以來，相繼已經(jīng)有一百多種治療性抗體藥物進入臨床應用，且每年都有新的抗體藥物處于研發(fā)和上市過程中。

圖1. 常見抗體藥物。包括CD3單抗，用于治療多種癌癥；英夫利西單抗(Infliximab) ，用于治療免疫系統(tǒng)紊亂如克羅恩病；阿達木單抗（Adalimumab），用于治療類風濕關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎； 依那西普單抗(Etanercept)，用于治療類風濕關(guān)節(jié)炎[1]。

隨著技術(shù)的發(fā)展，抗體篩選和發(fā)現(xiàn)的常用技術(shù)有噬菌體展示技術(shù)，轉(zhuǎn)基因鼠雜交瘤技術(shù)和單個B細胞技術(shù)。噬菌體展示技術(shù)實現(xiàn)了蛋白/多肽基因型與表型的統(tǒng)一，利用已有的基因片段可以快速的篩選得到所需抗體，但是其對文庫的依賴度比較高，無法應對抗體種類的多樣性和復雜性。轉(zhuǎn)基因鼠雜交瘤技術(shù)不需要經(jīng)過傳統(tǒng)的分子生物學表達重組抗體步驟，只需經(jīng)過動物免疫、細胞培養(yǎng)和細胞融合、小鼠腹水制備和單抗純化就可以完成目標抗體制備，但其仍然存在操作復雜，難度大，成功率低等缺點。單個B細胞技術(shù)具有效率高、人源性全、基因多樣性豐富等優(yōu)點。然而，迄今為止，單個B細胞抗體制備技術(shù)的應用潛力尚未發(fā)揮出來。單個B細胞抗體制備技術(shù)仍受到一些實際條件的限制，如高通量PCR抗體基因擴增技術(shù)不完善、某些靶抗原制備困難、對合適的人類供體需求量大等。而依賴于蛋白質(zhì)從頭測序的抗體發(fā)現(xiàn)技術(shù)操作簡便快捷，不依賴任何抗體文庫，并且可以應對各種各樣的抗體檢測，因而越來越受到抗體藥物發(fā)現(xiàn)及研發(fā)者的關(guān)注和青睞。

圖2.（左）噬菌體展示技術(shù)篩選單抗[2]，可快速篩選得到目標抗體但其對文庫的依賴度比較高，無法應對抗體種類的多樣性和復雜性；（右）轉(zhuǎn)基因鼠雜交瘤技術(shù)，不需要經(jīng)過傳統(tǒng)的分子生物學表達重組抗體步驟，但其仍然存在操作復雜，難度大，成功率低等缺點。

蛋白質(zhì)測序

抗體序列的發(fā)現(xiàn)有賴于基因測序和蛋白質(zhì)測序。與基因測序相比，蛋白質(zhì)測序產(chǎn)生的隨機匹配要少得多，更有利于新抗體序列的發(fā)現(xiàn)。在蛋白質(zhì)測序方法中，目前常用的有三種方法：基于Edman降解法的測序、肽譜分析和蛋白質(zhì)從頭測序（De novo sequencing）。其中，由于蛋白質(zhì)從頭測序具有不依賴任何蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，可以對任何未知蛋白質(zhì)進行全長測序的優(yōu)勢而成為獲得蛋白序列的首選技術(shù)。

圖3.三種蛋白質(zhì)測序方法對比[3]。Edman降解法只能對N末端幾十個氨基酸序列進行測定，肽譜分析需要依賴已有蛋白數(shù)據(jù)庫，而蛋白質(zhì)從頭測序（De novo sequencing）可以不依賴任何蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，對未知蛋白質(zhì)從頭測序。

目前，基于蛋白質(zhì)從頭測序發(fā)展而來的抗體測序技術(shù)已逐步受到包括基礎(chǔ)研究和抗體藥物開發(fā)人員的關(guān)注。快序生物的抗體發(fā)現(xiàn)平臺可以直接高效地發(fā)現(xiàn)在免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用且具高親和力的天然抗體，便于生產(chǎn)重組抗體，為抗體研發(fā)提供全新途徑。

圖4.快序抗體發(fā)現(xiàn)平臺

快序生物抗體發(fā)現(xiàn)平臺僅僅需要1 mg抗原親和純化的多克隆抗體，或3-5 mL血液的樣品量，再利用多種酶將包含多種抗體的蛋白樣本水解為短肽，進一步通過使用高精度質(zhì)譜儀(Thermo Orbitrap Fusion)進行檢測，以及從頭測序算法將串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)變?yōu)槎屉男蛄?，最終將短肽序列組裝回完整的高質(zhì)量的抗體蛋白質(zhì)序列。

快序生物自主研發(fā)的蛋白從頭測序技術(shù)突破了樣品的限制，可以在復雜樣品中獲得蛋白序列，打破傳統(tǒng)蛋白組學的數(shù)據(jù)庫依賴性，真正實現(xiàn)了對蛋白質(zhì)的從頭測序。其中，上?？煨蛏锟萍加邢薰驹谄?0多年的技術(shù)積累上，對抗體測序技術(shù)進行了持續(xù)優(yōu)化和升級，開發(fā)出了更加簡易、迅速和準確的抗體測序平臺。快序生物的蛋白從頭測序技術(shù)平臺的技術(shù)優(yōu)勢具體表現(xiàn)為：

1、更簡易，突破樣品局限

運用我們開發(fā)的獨特蛋白從頭測序技術(shù)可在復雜樣品中獲得蛋白序列，打破傳統(tǒng)蛋白組學的數(shù)據(jù)庫依賴性，真正實現(xiàn)了對蛋白質(zhì)的從頭測序。

2、更迅速，高通量測序獲取信息

通過高通量測序在工作中更快地獲取信息，并識別其他方法無法找到的特殊高質(zhì)量分子，大大縮減獲取蛋白測序結(jié)果的時間。

3、更嚴謹，百分百確保序列精度

該核心技術(shù)，確保了每一個氨基酸的正確性和全抗體的序列精度，抗體測序技術(shù)可確保序列的每個位點的氨基酸有超過十種不同的肽段支持，并在氨基酸水平上進行質(zhì)量控制，確保每個氨基酸在質(zhì)譜里有強的離子片段峰證據(jù)，可在抗體測序中準確區(qū)分Leu/Ile殘基。

快序抗體發(fā)現(xiàn)平臺應用場景

基于以上特點和優(yōu)勢，快序生物的抗體發(fā)現(xiàn)服務已經(jīng)在眾多領(lǐng)域得到了充分應用。這些實際應用更加凸顯了快序生物在抗體發(fā)現(xiàn)方面的專業(yè)性和行業(yè)領(lǐng)先性。

1、腫瘤中新的天然抗體發(fā)現(xiàn)：靶向治療已經(jīng)在許多腫瘤臨床治療中進行應用，而靶向治療的基礎(chǔ)就是對于腫瘤中各種天然抗體的發(fā)現(xiàn)。2022年發(fā)表于Cell的一篇題為《Tumor-reactive antibodies evolve from non-binding and autoreactive precursors》[4]的研究中提出了一種利用患者體內(nèi)天然抗體治療腫瘤的新方法。這種方法克服了目前依賴于已有蛋白序列開發(fā)靶向藥的缺點，為開發(fā)新型靶向藥提供了技術(shù)支持。而利用快序生物的蛋白發(fā)現(xiàn)平臺，研究人員可以快速對于體內(nèi)不同的天然抗體進行快速鑒定和開發(fā)，從而加速藥物研發(fā)進程。

2、前文中我們已經(jīng)提到抗體藥物目前已經(jīng)成為生物醫(yī)藥里的重要組成部分。而在面向未來的抗體藥物研發(fā)中，使用患者自身來源的天然抗體制備抗體藥物已成為一個重要的研究方向。2022年在國際頂級期刊Science Advances上發(fā)表的一篇題為《Rapid, site-specific labeling of “off-the-shelf” and native serum autoantibodies with T cell–redirecting domains》的研究性文章中，研究人員開發(fā)了一種可以將 T 細胞重定向結(jié)構(gòu)域特異性共價連接到任何現(xiàn)成的人免疫球蛋白G（IgG）或血清中分離的天然 IgG，只需數(shù)小時即可生成雙特異性抗體的技術(shù)。該技術(shù)可以使用癌癥患者自身的抗體來發(fā)現(xiàn)和治療自身癌癥，從而實現(xiàn)精準醫(yī)療和個性化治療。而利用快序生物的抗體發(fā)現(xiàn)平臺，我們可以快速準確的對生物體內(nèi)的新抗體進行測序鑒定，從而將上述實驗室成果快速推進至臨床，加快新型抗體藥物研發(fā)速度[5]。

3、自身免疫性疾病治療性抗體的研發(fā)：許多自身免疫性疾病的發(fā)病是因為致病性免疫球蛋白G（IgG）抗體的產(chǎn)生，隨后形成的免疫復合物從而對正常的細胞和組織產(chǎn)生毒害和攻擊作用，危害人類健康。而通過快序生物的抗體發(fā)現(xiàn)平臺，不依賴于已有的蛋白數(shù)據(jù)庫，可以迅速的對患者血液中的抗體進行分離檢測，從而開發(fā)出有針對性的治療抗體，從而開發(fā)針對性的臨床治療方案。

4、干預后免疫應答的識別：通過快序生物的抗體測序平臺可以對免疫應答中產(chǎn)生的天然后的抗體水平進行快速評估和干預。

5、多抗轉(zhuǎn)化為單抗或單抗混合物：根據(jù)抗體識別抗原表位的數(shù)量是否單一，抗體被分為單抗而多抗，而單抗的靶向治療效果優(yōu)于多抗，是臨床開發(fā)抗體藥物的首選。然而，單抗的開發(fā)過程耗時耗力，且技術(shù)難度較大。而在快速生物抗體發(fā)現(xiàn)平臺的支持下，可以將方便制備的多抗快速進行分析檢測，從而轉(zhuǎn)化為特異性單抗或單抗混合物，加快了單抗的制備過程。

總結(jié)

隨著人類醫(yī)療衛(wèi)生水平的不斷增加，抗體已經(jīng)在臨床診療中發(fā)揮了越來越重要的作用，各種抗體生物制品的研發(fā)也是生物醫(yī)藥領(lǐng)域的重要組成部分。然而，耗時耗力技術(shù)難度大限制了抗體制品的制備和研發(fā)?；诖?，快序生物打造的抗體發(fā)現(xiàn)品平臺，不僅突破了樣品種類和數(shù)量的限制，還提高了速度和精準度，極大降低了抗體制品的研發(fā)周期。

選擇快序生物抗體發(fā)現(xiàn)平臺，讓抗體研發(fā)不再“卡脖子”！

參考文獻：

[1] Smith, Susan L. "Ten years of Orthoclone OKT3 (muromonab-CD3): a review." Journal of Transplant Coordination 6.3 (1996): 109-121.

[2] Diebolder, P., & Krawczyk, A. (2017). Detailed Protocols for the Selection of Antiviral Human Antibodies from Combinatorial Immune Phage Display Libraries. In (Ed.), Antibody Engineering. IntechOpen

[3] Janin-Bussat, Marie-Claire, et al. "Characterization of antibody drug conjugate positional isomers at cysteine residues by peptide mapping LC–MS analysis."Journal of Chromatography B 981 (2015): 9-13.

[4] Roei D. Mazor et al, Tumor-reactive antibodies evolve from non-binding and autoreactive precursors, Cell (2022).

[5] Zappala F, Higbee-Dempsey E, Jang B, et al. Rapid, site-specific labeling of "off-the-shelf" and native serum autoantibodies with T cell-redirecting domains. Sci Adv. 2022.

[6] Mu?oz-Durango N, Pizarro-Ortega MS, Rey-Jurado E, Díaz FE, Bueno SM, Kalergis AM. Patterns of antibody response during natural hRSV infection: insights for the development of new antibody-based therapies. Expert Opin Investig Drugs. 2018.

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